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SHP1是一种胞质蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatase，PTP)，主要表达于造血细胞和某些上皮细胞。其在造血细胞中的主要功能是抑制细胞生长、增殖及分化。但在某些上皮细胞或异常表达该基因的某些实体瘤细胞中，SHP1的功能尚不明确，一些研究表明SHP1正向调控EGF诱导MAPK信号通路的活化，促进相应细胞生长，但是并不清楚其具体作用机制。一个重要原因是在实体瘤细胞中并不了解SHP1参与调节MAPK信号通路的作用底物。本研究旨在利用底物捕获技术检测SHP1在MAPK信号通路中的靶蛋白，并构建稳定表达SHP1底物捕获突变体的细胞株，为SHP1在MAPK信号通路中靶蛋白的进一步鉴定提供基础。
一、底物捕获法检测SHP1在MAPK信号通路中的靶蛋白实验中构建了SHP1CSDA-Flag、SHP1DAQA-Flag、SHPlTA-Flag的SHP1底物捕获突变体，重组质粒转染HEK293细胞，饥饿细胞16h后，EGF刺激细胞，细胞上清经Flag抗体免疫共沉淀，SDS-PAGE电泳、转印、磷酸化酪氨酸抗体免疫印迹检测与SHP1及其突变体相互作用的信号蛋白。结果显示EGF刺激后，在表达SHPlCSDA-Flag的HEK293细胞中，检测到一约90KD大小酪氨酸磷酸化蛋白，而在表达野生型SHP1-Flag的HEK293细胞中则检测不到这一蛋白，且在未经EGF刺激的表达野生型或突变型SHP1-Flag的HEK293细胞中均未检测到这-90KD酪氨酸磷酸化蛋白，说明此90KD蛋白可能为SHP1参与EGF活化MAPK信号通路的靶蛋白之一。
二、稳定表达S肿lCSDA-Flag细胞株的构建由于SHP1-Flag的CSDA双突变体可以捕获SHP1在MAPK信号通路中的90KD靶蛋白，但是利用一些相应大小的抗体却未能鉴定这一蛋白，因此必须通过其他手段鉴定该蛋白。本研究利用：Invitrogen公司的Flp-InTM系统建立了稳定表达SHPlCSDA-Flag的细胞株-Flp-In TM-293-SHP1CSDA-Flag。Western blot实验证实SHP1CSDA-Flag可高效特异表达。细胞上清经Flag抗体免疫共沉淀后，磷酸化酪氨酸抗体免疫印迹检测到与SHPlCSDA-Flag相结合的90KD靶蛋白。因此只要通过大规模培养该细胞株(约1×109个细胞)并借助于Flag抗体的免疫共沉淀实验获取足够量的90KD蛋白，就有可能通过蛋白质组学方法鉴定该蛋白。