前列腺癌在老年男性生殖系统常见。在国外,前列腺癌的发病率与死亡率仅次于肺癌,居第二位。在国内,随着寿命的延长和生活方式的改变,其发病率也在增长,已成为严重威胁男性健康和生命安全的主要疾病。早期发现并且身体条件允许的患者可以实行手术治疗;但是大多数患者发现时都已经是晚期,对这些病人目前没有很好的治疗方案,患者的平均生存率只有大约3年。因此,寻找新的前列腺癌治疗方法显得尤为迫切。基因治疗由于能对致病基因进行修复,替代和删除从而发挥治疗作用而成为近年来的研究热点。利用前列腺特异性的启动子来表达外源基因,从而达到根治或控制前列腺癌的目的,这是令人瞩目的一个研究方向。probasin是一种自大鼠背外侧叶前列腺的细胞核中分离出的蛋白质,氨基酸序列分析表明它属于lipocalin超家族(一种配体转运蛋白),免疫组织化学研究表明这种蛋白质位于前列腺上皮细胞内和前列腺分泌液中,经研究发现probasin蛋白质的表达受雄激素的调控并且具有前列腺组织特异性。所以probasin启动子继前列腺特异抗原(PSA)启动子之后成为又一个受到关注的对象。caspase的活化是不同细胞凋亡途径中共同的下游事件。caspase-3是最主要的效应caspase之一,它在细胞中以酶原形式存在,一级结构中自N端起依次为原结构域(prodormain)、大亚基和小亚基。细胞发生凋亡时,caspase-3被上游caspase切割,原结构域被去除,大、小亚基之间发生断裂,并重新组装成具有活性的caspase-3分子。活化caspase-3可以作用于细胞内多种结构和功能蛋白,引起细胞凋亡。本实验首先利用PCR的方法从大鼠前列腺组织中克隆出(-426～+28bp)的probasin启动子序列,经测序正确后利用交叠PCR技术克隆出含有2个雄激素反应元件的ARR2PB启动子序列,把两个正确的启动子序列插入到pPRIME表达载体以及荧光素酶载体pGL3-Basic,构建由PB和ARR2PB启动子调控的表达GFP的pPRIME载体和荧光素酶载体,并把PGL3载体上的荧光素酶基因切下插入到CMV启动子调控的pcDNA3.1 His A载体中作为对照,把以上载体转染入不同的前列腺癌、非前列腺癌细胞系及正常细胞系中验证启动子的活性和特异性,并用pEGFP-N2载体作为瞬时转染率的对照。GFP绿色荧光观察结果显示两种启动子具有前列腺的组织特异性,在LNCaP中荧光最强,其中ARR2PB启动子的活性明显高于PB启动子。流式细胞术检测荧光表达量以及荧光素酶的检测结果都证实了所看到的荧光结果,即probasin启动子具有前列腺的组织特异性,其中启动子的活性依次是CMV>ARR2PB>PB。接着把构建的PB-pPRIME和ARR2PB-pPRIME表达载体上的GFP序列替换成caspase-3序列,构建了由PB和ARR2PB调控的PB-pPRIME-caspase-3, ARR2PB-pPRIME-caspase-3,以及未替换CMV启动子的pPRIME-caspase-3对照载体,把以上载体转染入激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP和激素非依赖PC3细胞,用间接免疫荧光染色检测caspase-3基因在细胞中的表达,流式细胞术,Hoechst33258染色,电镜观察等方法检测促凋亡作用。间接免疫荧光染色结果表明,转染以上载体后前列腺癌细胞中有caspase-3阳性细胞的出现,与正常未转染构建载体的对照细胞相比阳性细胞数目明显增加。Hoechst33258染色,电镜等方法显示两种不同形式的启动子都能介导caspase-3的促凋亡作用,其中在转染了pPRIME-caspase-3,PB-pPRIME-caspase-3以及ARR2PB-pPRIME-caspase-3后流式细胞术显示LNCaP的凋亡率分别是10.55﹪,7.74﹪和10.5﹪,而在PC3中的凋亡率分别为71.71﹪,57.56﹪和61.82﹪。与pPRIME质粒转染组相比,pPRIME-caspase-3, PB-pPRIME-caspase-3和ARR2PB-pPRIME-caspase-3重组质粒转染组的细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。本实验详尽比较了两种probasin启动子的组织特异性和活性,证明了probasin在前列腺癌中介导的促凋亡作用,为进一步研究组织特异性启动子介导的肿瘤的杀伤作用,以及前列腺肿瘤治疗新方法奠定了基础。