抗生素不规范使用加剧了耐药性细菌的产生,给人类健康带来严重威胁,迫待寻求新的抗菌制剂。抗菌肽不仅能直接抗菌,而且参与生物体免疫调节,是极具潜力的感染治疗药物。本实验尝试基于抗菌肽结构与活性关系,使用生物信息学工具优化设计与筛选杂合抗菌肽。选择牛乳铁蛋白衍生肽LFB15-W4,10、天蚕素A（cecropin A）、幽门螺杆菌肽HP（2-20）作为母体肽,截取不同片段进行杂合,以求获得高抗菌活性低溶血性的杂合肽。使用生物信息学工具计算杂合肽的物化参数,预测二级结构,优化参数和结构,选择合成了两条最具潜力的杂合肽:CA（1-8）-LFB15W（4,10）,简称CL23;LFB15（W4,10）-HP（4-16）,简称LH28,并测定合成肽活性,验证设计的合理性。与母体肽相比,杂合肽抗菌谱更广,抗细菌活性增强,并且在有效抑菌浓度下无明显溶血性;对大肠杆菌抑菌活性均比母体肽LFB15-W4,10提高了4倍;实验结果表明抗菌肽两亲性是影响其抑菌活性的关键结构特征;疏水性过强,正电荷过高会增加抗菌肽的溶血性。本实验尝试建立杂合肽的大肠杆菌重组高效表达与纯化分离系统。比较研究了对杂合肽的高效表达和纯化的影响因素:单体和多聚体表达、不同融合蛋白标签的毒性屏蔽和表达促进作用、融合蛋白酶法和化学法裂解、不同宿主对表达产物的耐受力。首先,在E.coli BL21（DE3）中融合表达单体CL23与LH28。根据E.coli密码子偏爱性设计基因,在其5’端设计Xa因子的酶切位点编码序列和限制性内切酶EcoR I、Not I酶切位点,选择pET28a（+）、pET32a（+）和pET41a（+）作为表达载体,正确构建了六个重组表达载体。经IPTG诱导表达, pET28a重组载体在SDS-PAGE凝胶上没有目的蛋白条带,pET41a重组载体以包涵体形式表达融合蛋白;pET32a重组载体以可溶形式表达融合蛋白,利于后续酶切;选择pET32a重组表达载体进行表达纯化,镍离子亲和层析柱（Ni柱）纯化融合蛋白纯度约90%。但Xa因子切割的特异性不强,效率不高,增加了纯化的难度;体系放大后,酶用量增加,成本增加。在单体表达研究基础上,选择LH28进行多聚体表达,提高杂合肽在融合蛋白中的比例,提高得率。多聚体重组肽与载体蛋白及各单体间均设计甲酸和羟胺的切割位点,按照大肠杆菌密码子偏爱性,设计LH28单体基因,并在两端设计非对称性限制性内切酶BbsI酶切位点,用于单体间串联;利用基因两端的限制性内切酶KpnI和HindIII酶切位点,构建重组克隆载体pUC19-LH28;以pUC19-LH28为模板PCR获得LH28单体基因,并利用BbsI酶切获得线性载体pUC19和带有粘性末端的单体基因;正确构建了2-6聚体和8聚体的重组克隆载体pUC19（-LH28）2-6,8。利用限制性内切酶KpnI和HindIII酶切位点,将多聚体基因序列插入到pET32a（+）,正确构建了重组表达载体pET32a-（LH28）_2-6,8。诱导表达引起宿主大肠杆菌BL21（DE3） OD600nm明显下降,而宿主大肠杆菌C41（DE3）与C43（DE3）,诱导过程OD600nm没有下降,其对外源蛋白表达的耐受力显著高于BL21（DE3）。在SDS-PAGE凝胶上除了2聚体融合蛋白外,3-6和8聚体融合蛋白均没有目的蛋白条带;在相同诱导条件下C43（DE3）的菌体生长量（OD600nm）最高,C43（DE3）中融合蛋白Trx-（LH28）2表达量最高,占菌体总蛋白的35%,经Ni柱纯化,Trx-（LH28）2纯度95%以上,1升发酵液可纯化得到63 mg;使用50%甲酸于50℃,切割36h,Trx-（LH28）2被有效切割,Ni柱纯化重组单体杂合肽（P-LH-D）纯度85%以上,对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌活性与合成肽LH28大体一致。实验结果表明利用生物信息学工具辅助设计和筛选杂合抗菌肽的方法,对杂合抗菌肽的分子设计具有一定的指导作用,节约了新型抗菌肽设计与筛选的时间和成本,杂合肽CL23和LH28可做为改造设计新型抗菌肽的模板。本实验实现了杂合肽LH28二聚体融合蛋白Trx-（LH28）2在大肠杆菌C43（DE3）中的高效表达;其绝大部分以包涵体形式表达,利于分离纯化;甲酸对难溶于水的蛋白质良好的溶解性,使得包涵体纯化后,不必进行复性,并降低了酶法的高成本;初步建立了杂合抗菌肽原核高效表达和融合蛋白切割分离纯化体系,为抗菌肽制备和应用奠定了基础。