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植物内生真菌是一类具有重要价值的资源微生物,在促进农业的可持续发展和医药领域中具有广阔的应用前景。臂形草是一种重要的禾本科牧草,许多种已在世界热带和亚热带地区广泛种植,它们作为牧草的重要性已日趋明显。禾草类植物普遍被内生真菌感染,二者形成了互利共生的关系。本文对9种臂形草品系包括多枝臂形草(Brachiariaramosa)、四生臂形草(B.subquadripara)、杂交臂形草(B.hydrid)、刚果臂形草(B.ruzizensis)、网脉臂形草(B.dictyoneura)、湿生臂形草(B.humidicola)、巴拉草(B.mutica)、俯仰臂形草(B.decumbens)和珊状臂形草(B.brizantha)的叶片进行了苯胺蓝染色检测内生真菌,发现它们的带菌率分别为90%,60%,71.4%,60%,50%,50%,40%,100%和70%。
采用组织块分离法对9种臂形草叶片进行了内生真菌的分离。利用严格的表面消毒程序,以PDA培养基(加10μg/mL四环素)为分离培养基,从叶片内分离到11份内生真菌分离物,利用菌丝顶端直接挑取法或孢子悬浮液稀释法进行纯化培养获得纯培养物,并采用了四种保存方法包括4℃平板保存,-20℃滤纸片保存,常温超纯水保存和-20℃臂形草种子保存对其进行了保存。
利用平板对峙培养法,将所有分离物与芒果炭疽病病原菌(Colletotrichumgloesporioides)菌株SC2进行拮抗测定,结果只有从珊状臂形草中分离出的菌株HND5对其具有明显的抑制效应,抑菌率为51.2%。该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上生长缓慢,培养1周直径为2.7cm,菌落质地紧密潮湿,白色、紫红色或橘红色,光照能够促进颜色加深。显微观察发现,菌丝纤细,分生孢子单孢、无隔,短圆桶状、椭圆状、纺锤状,杆状或球状,大小为1.23~1.62μm×1.93~2.88μm,它们在分生孢子梗瓶梗顶端聚集形成典型球形头状结构,分生孢子梗由菌丝上直角生出,梗顶部比基部细。这些形态特征与半知菌亚门顶孢霉属真菌(Acremoniumsp.)的特征相同。采用通用引物分别对HND5的ITS-5.8SrDNA序列和β微管蛋白基因部分序列(内含子1-3)进行了PCR扩增、克隆及测序,分别得到了585bp和795bp的序列,基于这些序列,分别构建了邻接树和进行了系统发育分析,结果表明菌株HND5与子囊菌亚门真菌特别是顶孢霉属真菌进化关系最近。综合其培养形态特征和分子分析,将菌株HND5初步鉴定为半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)丝孢目(Moniliales)顶孢霉属(Acremoniumsp.)真菌。
对HND5菌株的基础生物学特性研究发现,最适宜温度为28℃,最适pH为7,最适固体培养基为PDA,最适液体培养基为SM-TE培养基,最适碳氮源分别为蔗糖和硝酸钠。该菌株只对浓度为1%的NaCl、NaOH、KOH和Na2CO3具有耐受性,不能在高于1%的条件下生长,但是能够耐受5%浓度的KCl。该菌株还能耐受到供试浓度为1000μg/mL重铬酸钾。
利用热处理带菌的臂形草种子,处理后经检测其除菌率达到了84.3%。利用不带菌的幼苗进行了HND5菌株回接,共接种223株,获得34株成活幼苗,成活率为14.1%。只从3株植株中分离出HND5菌株。在另外的18株植株中只能够染色检测到内生真菌,但未能分离到内生真菌,其它13株中未能检测出内生真菌。
内生真菌菌株HND5对11种供试植物病原真菌(芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、竹子枯萎病菌、橡胶树炭疽病菌、橡胶树棒孢霉落叶病菌、木瓜棒孢霉病菌、臂形草叶斑病菌、水稻稻瘟病菌、水稻胡麻斑病菌、甘蔗赤腐病菌)在离体培养条件下的生长抑制试验表明,在固体平板上测试时,该内生真菌对所有供试的病原真菌都具有很强的生长抑制作用,对水稻胡麻斑病菌的抑制率最高,为91.0±3.4%,而对芒果炭疽病菌的抑制率最低,为51.2±0.7%;测试无菌过滤液体PDA发酵液活性时,该菌株只对水稻胡麻斑病菌、木瓜棒孢霉病菌和臂形草叶斑病菌具有抑制活性。而HND5产挥发性气体化合物的活性测定结果与固体平板测试结果相同,均能够强烈抑制所有供试病原真菌,但对水稻稻瘟病菌的抑制率最高(86.7±2.2%),抑制率最低的为橡胶树棒孢霉落叶病菌(62.3±1.4%)。
HND5对香蕉根结线虫寄生试验的结果发现,接种培养约60小时后该菌菌丝套住线虫并寄生致线虫死亡,而且其无菌过滤的液体PDA发酵液也具有显著的杀线虫活性。进一步的室内盆栽防治香蕉根结线虫试验结果表明,施用该菌的液体PDA发酵液能够显著减少感病盆栽苗的根结数量,增强生长优势。
利用菌株HND5的菌丝制备了原生质体,成功进行了绿色荧光蛋白基因(gfp)的转化,获得了21株能够强烈产生绿色荧光的HND5转化子。而且在各转化子内,绿色荧光蛋白(GFP)均为组成性表达,在菌丝、分生孢子梗和分生孢子等结构内都能产生荧光,这些转化子的获得为研究内生真菌菌株HND5在臂形草组织内的分布、定殖、行为机制及内共生机理的研究提供了极好的材料。