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APRIL（a proliferation-inducing ligand,增殖诱导配体）是肿瘤坏死因子（TNF）超家族的新成员之一。有膜结合型和可溶性两种活性形式。APRIL的105-250氨基酸区域为天然可溶性APRIL（soluble APRIL,sAPRIL）,其与全长（即膜结合型）APRIL具有相同的生物学活性,二者在体外均可以促进多种肿瘤细胞系的增殖。APRIL在正常组织中表达量很低,但在多种肿瘤细胞株和肿瘤组织如结直肠癌、乳腺癌、肺癌、血液系统肿瘤、黑色素瘤、膀胱癌中有高水平表达。作为一种配体蛋白,APRIL通过与其受体结合而发挥促瘤效应。B淋巴细胞成熟抗原（B cell maturation antigen,BCMA）和跨膜激动子和钙信号修饰环亲素配体作用子（transmembrane activator and calcium signal-modulating cyclophilin ligandinteractor,TACI）是目前公认的APRIL受体。最近有报道表明,粘蛋白多糖（syndecans,S）可能也是APRIL的受体。目前研究尚无APRIL与宫颈癌或其细胞株增殖之间有否关联的报道。本研究拟观察sAPRIL是否具有促进宫颈癌细胞株HeLa增殖的作用,并对HeLa细胞及宫颈癌组织、癌前病变组织中的APRIL及其受体mRNA的表达情况以及APRIL蛋白在宫颈癌组织的表达情况进行研究,在此研究的基础上设计制备sAPRIL的两个突变体,观察突变体在体外对HeLa细胞增殖的影响以及对野生型sAPRIL的竞争抑制作用,从而为进一步了解APRIL在宫颈癌的发生、发展中的作用以及针对抑制APRIL的抗宫颈癌制剂的制备奠定基础。为了了解APRIL在宫颈癌发病中的作用,本研究用RT-PCR及免疫组化检测了宫颈癌、癌前病变中APRIL mRNA及蛋白的表达水平,发现宫颈癌组织中APRIL的mRNA和蛋白的表达均显著高于癌前病变和正常组织。同时我们用RT-PCR检测了组织中APRIL受体mRNA的表达情况,发现与正常组织及癌前病变比较,癌组织中BCMA、TACI及粘蛋白多糖-4（S4）的表达水平无显著差异,而随着细胞异型性的加重,粘蛋白多糖-1（S1）表达逐渐下降,而粘蛋白多糖-2（S2）的水平逐渐增高。之后我们用RT-PCR法检测了HeLa细胞中APRIL及其受体mRNA的表达情况,发现HeLa细胞表达APRIL、S1和S2,而不表达BCMA、TACI及S4。为了进一步了解APRIL在宫颈癌发病中的作用,我们用BrdU-ELISA法检测了sAPRIL蛋白对人宫颈癌细胞株HeLa细胞增殖的作用,发现sAPRIL蛋白能以剂量依赖的方式促进HeLa细胞的增殖。鉴于APRIL有促进宫颈癌细胞株HeLa细胞增殖的作用,抑制APRIL的功能活性,将可能为宫颈癌的治疗提供新途径。研究表明APRIL抗体和APRIL的可溶性受体能够在一定程度上抑制APRIL的功能,但是人源性抗体获得困难,而APRIL的受体多,一种可溶性受体并不能起到抑制APRIL与其他受体结合而起作用的功能。因此本课题拟从改建APRIL分子本身入手,构建能够与受体结合但不能引发受体后促瘤效应的APRIL突变体,以期获得APRIL的抑制剂,达到治疗肿瘤的目的。本课题借鉴改建BLyS（B-lymphocyte stimulator,B淋巴细胞刺激因子）分子的方法,在与BlyS进行同源序列比对以及对APRIL分子进行结构分析后,选择APRIL第186、187位氨基酸作为突变位点,以pUC19/sAPRIL为模板,用一步反向PCR致突变法构建了人msAPRIL-1（186G187Q置换为186K187G）及msAPRIL-2（186G被K置换,187Q缺失）两个突变体DNA序列;将上述测序正确的突变型目的片段连接于原核表达载体pQE-80L,成功构建了重组原核表达质粒pQE-80L/msAPRIL-1和pQE-80L/msAPRIL-2;将重组原核表达质粒分别转化于大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,获得了较高水平的表达,SDS-PAGE分析可见,两重组蛋白的大小约为19kDa,主要是以包涵体的形式存在,Western blotting分析显示,两蛋白均在分子量约19kDa处出现单一条带;经Ni2+-NTA纯化系统及尿素透析,两重组蛋白得到了有效纯化和复性。纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现单一条带。经Sephadex G-75凝胶过滤层析得到两重组突变体蛋白三聚体分子。生物学功能分析显示,所制备的msAPRIL-1突变体蛋白能很好地与HeLa细胞结合,而msAPRIL-2与HeLa细胞只有微弱的结合;同时两突变体均不能促细胞增殖。进一步分析显示msAPRIL-1可以抑制野生型sAPRIL对HeLa细胞的促增殖作用。本研究主要结果总结如下:一、APRIL及其受体在宫颈鳞癌组织和细胞株中的表达1.APRIL在宫颈鳞癌组织无论在mRNA还是在蛋白水平的表达均显著高于正常鳞状上皮和鳞状上皮内病变,随着细胞的增殖与异型性的加重表达水平逐渐增高;S1mRNA随着宫颈鳞状上皮细胞的增殖和异型性的加重表达逐渐下调,而S2 mRNA表达逐渐增高;BCMA、TACI及S4 mRNA在正常组织、炎症、癌前病变、原位癌及浸润癌中的表达无显著差异;2.宫颈癌HeLa细胞有APRIL、S1及S2 mRNA的表达,而不表达BCMA、TACI及S4的mRNA;二、sAPRIL在体外以剂量依赖方式促进人宫颈癌细胞株HeLa细胞的增殖。通过以上两方面的结果,可初步得出如下结论:APRIL及其受体在宫颈癌的发展中可能起一定的作用,其中APRIL在宫颈癌中的作用可能是通过与S1和/或S2结合而发挥的;而S1 mRNA的降低和/或S2 mRNA及APRIL的表达升高可能可以作为病情进展的预警指标。三、成功制备了sAPRIL的两个突变体1.以APRIL第186、187位氨基酸作为突变位点,用一步反向PCR致突变法成功构建了人msAPRIL-1 DNA（186G187Q置换为186K187G）及msAPRIL-2 DNA（186G被K置换,187Q缺失）两个突变体序列。2.将突变目的DNA片段连接于原核表达载体pQE-80L,成功构建了重组原核表达质粒pQE-80L/msAPRIL-1和pQE-80L/msAPRIL-2。3.将重组原核表达质粒分别转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,使重组突变体蛋白获得了成功表达。4.经Ni2+-NTA纯化系统及尿素透析,两重组蛋白得到了有效纯化和复性;经Sephadex G-75凝胶过滤层析得到了两重组突变体蛋白三聚体分子。四、突变体的功能分析1.所制备的msAPRIL-1突变体可特异地与HeLa细胞结合,而msAPRIL-2与HeLa细胞的结合能力很弱。2.msAPRIL-1和msAPRIL-2均丧失了促HeLa细胞增殖的功能。3.msAPRIL-1突变体能在一定程度上竞争抑制野生型sAPRIL促HeLa细胞增殖的功能,而msAPRIL-2的作用则不明显。以上三、四两部分的结果提示,msAPRIL-1及其衍生分子可能在宫颈癌等APRIL相关肿瘤的治疗中具有潜在应用前景。