近年来流行病学研究已经建立了柴油尾气颗粒物（diesel exhaust particles,DEPs）与神经系统疾病发生发展之间的关联。高水平的氧化应激反应激活含NLR家族pyrin域蛋白3（the NLR family,pyrin domain containing 3,NLRP3）介导的炎症通路,是炎症反应激活的关键通路。而小胶质细胞激活的神经炎症被证实涉及神经元损伤的上游环节。在本课题中,我们在细胞和动物两个水平研究DEPs暴露引发的神经损伤过程。结果发现DEPs引起的氧化应激通过激活小胶质细胞中NLRP3炎性小体,促进了炎症反应的进程,造成神经损伤;而抑制NLRP3的表达后可以阻断DEPs介导的神经损伤。行为学试验证实,抑制NLRP3炎性小体活性可保护由DEPs介导的海马相关空间学习和记忆能力损伤,为进一步研究DEPs暴露诱导神经损伤的分子机制提供新线索。一、DEPs暴露诱导的小鼠神经毒性作用1.探讨DEPs暴露对神经系统的影响。配制浓度为0.1和1μg/μL的DEPs标准参考物悬浊液以及磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）,通过小鼠鼻腔滴注的方式分别连续暴露14天。利用morris水迷宫实验（morris water maze,MWM）评估DEPs暴露小鼠空间学习和记忆行为的改变。所有小鼠在暴露前接受获得性训练（连续4天,每天3次）。在暴露DEPs后的第1天和第14天,所有小鼠接受定位航行试验（连续4天,每天3次）。定位航行试验完成之后的第一天,移除平台,进行空间探索试验。使用摄像系统记录实验过程中小鼠进入平台象限的时间、频次等数据,然后采用Noldus Ethovision XT软件分析试验记录的数据。结果显示,小鼠逃避潜伏期时间明显增长,这种影响持续到DEPs暴露后的第16天（p＜0.05）。空间探索试验中,在DEPs暴露后的第5和第19天,小鼠进入平台象限的频次和平台象限停留时间均显著减少（p＜0.05）。小鼠游泳速度在暴露组和对照组之间没有显著差异（p＞0.05）。2.组织病理显示,脑组织神经元细胞形态没有发生明显改变。1μg/μL DEPs暴露组小鼠的肺、肝和肠组织均出现轻微的炎症反应。二、海马区小胶质细胞活化在DEPs暴露致神经毒性中的作用机制在上述研究中,试验证实DEPs暴露所致的空间学习和记忆行为改变,但是脑组织神经元并没有明显损伤。为了进一步明确DEPs诱导神经损伤过程中的关键调控分子,本研究利用体内外模型,并结合病理学和分子学实验,探究与空间学习和记忆相关的海马区小胶质细胞活化在DEPs暴露致神经毒性中的作用机制。1.MWM实验结束后收取DEPs暴露模型小鼠的脑组织,免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）评分表明,小鼠海马区中Iba-1+小胶质细胞数量在暴露后的第5天和第19天均显著增多（p＜0.01）。2.为进一步探究小胶质细胞激活的作用,利用荧光分光光度计检测DEPs暴露小鼠脑组织中的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,采用流式细胞术检测永生化小鼠小胶质细胞（BV2）中ROS水平。体内外实验结果均表明,DEPs暴露后ROS水平显著升高（p＜0.01）。DEPs暴露导致细胞外泌的一氧化氮（nitrogen oxide,NO）水平和细胞内的丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平显著升高（p＜0.05）,但未改变超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化氢酶（catalase,CAT）的活性（p＞0.05）。3.分子表达水平上,我们对炎症通路关键基因进行了q RT-PCR检测。结果发现直到DEPs暴露后的第19天,脑组织中p65和Nlrp3的m RNA仍处于高表达水平（p＜0.05）。并且NLRP3+细胞数量也显著增多（p＜0.001）。体外实验中,BV2细胞的NLRP3的基因和蛋白表达水平与体内实验结果一致（p＜0.05）。4.进一步我们采用ELISA的方法检测炎性小体通路中关键炎症因子在体内外模型中的表达水平。对小鼠脑组织匀浆中NLRP3炎性小体活化标志性细胞因子白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和白介素-18（interleukin-18,IL-18）的蛋白水平进行检测,发现IL-1β和IL-18在DEPs暴露后第19天仍显著上调（p＜0.05）,体外模型结果与体内结果一致。5.为深入探索DEPs暴露致小鼠神经毒性的机制,本研究进一步收集DEPs暴露的BV2细胞进行代谢组学分析。分析表明,20μg/m L和50μg/m L DEPs暴露组分别改变了BV2细胞中15和13种代谢产物的表达水平。对两组共同的9种差异代谢产物进行通路富集分析,结果发现“牛磺酸和亚牛磺酸代谢”通路富集倍数最大。三、Nlrp3基因敲除缓解DEPs暴露诱导的小鼠神经毒性作用为充分探讨NLRP3在DEPs诱导的神经损伤过程中的作用机制,我们通过构建DEPs暴露Nlrp3基因敲除(Nlrp3-/-)小鼠模型,反向验证NLRP3对DEPs神经毒性的调控作用。1.通过IHC验证Nlrp3-/-小鼠模型构建成功与否,结果显示,Nlrp3-/-小鼠脑组织中不表达NLRP3蛋白。2.MWM实验表明,DEPs暴露并没有影响Nlrp3-/-小鼠找到平台的时间。空间探索试验中,高剂量DEPs暴露组的Nlrp3-/-小鼠进入平台象限的频次和停留时间与对照组相比没有发生显著改变（p＞0.05）。3.通过IHC评估DEPs暴露的野生（WT）型和Nlrp3-/-小鼠中小胶质细胞数量的变化,结果显示,DEPs暴露的Nlrp3-/-小鼠中小胶质细胞多处于静息状态,Iba-1+细胞数量与野生型小鼠无显著差异（p＞0.05）。4.ELISA的结果显示,Nlrp3基因敲除抑制了DEPs诱导的IL-1β和IL-18蛋白高表达水平。综上所述,我们建立了DEPs暴露小鼠模型,并诱导其空间学习和记忆行为发生改变,探明在该过程中发挥关键作用的分子机制,并在细胞和动物水平进行了验证。结果表明DEPs暴露可以诱导海马区神经炎症的发生,从而影响空间学习和记忆能力。结合体内外分子机制研究,分析发现NLRP3是DEPs暴露致神经毒性进程中的关键机制分子。进一步构建Nlrp3-/-小鼠反向验证其在神经损伤中发挥的关键作用。我们发现抑制NLRP3表达可以阻断由DEPs激活的小胶质细胞炎性小体,并有效抑制DEPs暴露诱导空间学习和记忆损伤的能力。因此,研究结果表明NLRP3可能是预防和缓解DEPs暴露致神经损伤的潜在靶点,同时,本研究结果为制订大气污染暴露致神经系统损伤相关的干预措施提供了新的理论依据。