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环境胁迫是植物生长繁殖与农作物生产的主要限制因素。协助植物抵抗非生物胁迫需要运用新的研究手段,这包括了以抗逆相关基因的研究及其转化技术为内容的遗传工程。全球广泛种植的重要农作物——大豆,同样严重地受到环境胁迫的影响,而转基因技术则为大豆的形状改良以及大豆产业的发展提供了可能。
尽管这些技术十分重要,但必须首先建立起一个可靠有效的转化细胞再生体系。这项研究的内容包括将黄花苜蓿的MfTIL与MfSUC基因转化到烟草中,并测定转基因烟草植株对不同非生物逆境,如干旱、盐、低温及氧化胁迫等的生化与生理反应。其目的还包括利用华夏1号、华夏3号、华春3号、华春6号和吉林小粒等五个国内大豆品种,建立一个大豆体外转化与再生体系。
这篇论文总共分为四个章节:第一章,文献综述;第二章,MfTIL基因的功能分析;第三章,MfSUC基因的功能分析;第四章,农杆菌介导转化大豆的组织培养与再生体系的建立。
在第二章里,已经得到超表达MfTIL基因的转基因烟草的T1代植株。利用T1、T2、T29等株系的MfTIL转基因以及野生型烟草的植株及叶片,检测其在干旱、盐、低温及氧化胁迫等逆境下的生理指标。结果整理如下:
通过测定冷处理后植株幼苗与叶圆片的相对电导率,发现MfTIL的三个转基因株系T1、T2、T29的电解质渗漏要明显低于野生型,而这三个转基因株系之间并没有明显的差别。这说明了MfTIL基因是转基因烟草的耐寒性得到了提高。
经过一个月的干旱(0.1M甘露醇)与盐(0.1M氯化钠)处理之后,只有T29株系的抗旱性有所提高,而MfTIL基因并没有提高植株的耐盐性。幼苗经过一天的100到150μM的百草枯处理之后,大部分的野生型幼苗叶片上都呈现枯黄的状态,然而MfTIL转基因株系只有小部分呈现枯黄,通过测定发现野生型的相对电导率要明显高于转基因株系。测定经过短时间的0.1mM的百草枯处理与长时间的0.01mM的百草枯处理的叶圆片的相对电导率,也能得出相同的结果,而野生型的最大光化学效率Fv/Fm则低于转基因烟草。通过叶绿体荧光参数(Fv/Fm,ΦPSⅡ, qP, NPQ等)、相对电导率和光合效率的比较发现,野生型明显比MfTIL转基因烟草更容易受到低温的伤害。
在第三章里,已经得到超表达MfSUC基因的转基因烟草的T1代植株。利用S1、S3、S6等株系的MfSUC转基因以及野生型烟草的植株及叶片,检测其在干旱、盐、低温及氧化胁迫等逆境下的生理指标。结果整理如下:
通过测定经过低-4℃温处理2到3小时的T1代MfSUC转基因株系与野生型烟草的相对电导率发现,两者之间具有明显的差异。同样,将正常生长状态下的烟草植株移到3℃下光照培养4天,测定其相对电导率、叶绿体荧光参数(Fv/Fm,ΦPSⅡ, qP, NPQ等)、和光合效率,其结果MfSUC转基因烟草总是优于野生型,说明MfSUC基因的确能提高植物的耐寒性。经过干旱和盐处理后,转基因植株的根部、地上部以及整株植株的相对生长量都要明显大于野生型,说明MfSUC基因能提高植物的耐旱性与耐盐性。在正常情况下,野生型烟草叶片的蔗糖含量要高于转基因烟草,而转基因烟草根部的含糖量却明显高于野生型。这结果表明,MfSUC蛋白作为一个蔗糖转运体,使到转基因烟草的蔗糖从生成部位——叶片转运到其储藏部位——根部。
在第四章里,不同组合的NAA和6-BA被用来研究它们在体外对四个大豆品种多种外植体的效果,包括华春3号,华春6号,华夏1号和华夏3号。细胞分裂素的不连续处理将目标再生组织的发育定位于植物的下胚轴和子叶之间。含1.0mg·L-16-BA的MS培养基不管有无NAA,都比起其他的浓度更能有效促进发芽再生。当6-BA的浓度增加到1mg·L-1时不管有无NAA,均能抑制4个测试品种的平均发芽率和芽长。其中缺乏NAA的培养基有相对较长的芽长。最大芽长的在含1mg·L-16-BA和0.1mg·L-1NAA的MS培养基培养的华夏1号中被发现,而华春3号,华春6号,和华夏3号在含1mg·L-16-BA的培养基中不管有无0.1mg·L-1NAA.,均呈现出3.1的再生率。
同样在第四章,涉及了一种改进了的大豆转化体系,确定了共培养温度和筛选策略。这种系统的适用性在五种国内的重要大豆品种中被证明。在转化后,相较其他外植体,其在25-26℃的共培养温度下有最大GUS阳性染色率(转化率),并且转化率随着该温度的下降而下降。子叶节外植体比其他外植体有更高的GUS阳性染色率。其中华夏1号、华夏3号和吉林小粒品种的子叶节外植体的GUS染色率最大(达到100%)。在加入了5mg·L-1的Basta或潮霉素的选择培养基上经过一个月的培养,所有测试品种均不能存活,甚至在6mg·L-1浓度时也是如此。证明了5mg·L-1浓度的Basta或潮霉素对不同品种被测大豆的选择均有效。