论文部分内容阅读
微生物发酵产生的胞外多糖作为继动植物多糖和藻类多糖的又一大分支,拥有其他来源多糖无法比拟的优势,如发酵产多糖过程中可控的生长条件、发酵液中粗糖简单的提取方法、发酵多糖的短时间生产等。随着对庞大微生物资源的不断开发,人们发现了越来越多的具备丰富应用前景的微生物胞外多糖。微生物多糖优异的性质提高了许多产品的价值和应用范围,但市面上可见的微生物多糖种类有限,因此寻找新型的、有强的应用潜力的微生物多糖对其进一步发展非常重要。和普通环境微生物相比,极端微生物自身的某些沉默基因可能受环境影响而表达,进而激活新型的代谢途径并产生新型多糖。本文鉴于这类极端微生物可能产生新型应用优势多糖的潜力,从高渗透压的两种盐环境（低水活度腊肉和富水海洋）中筛选极端微生物。在此基础上利用高盐培养基发酵胞外多糖,并对其进行分离纯化、初步的结构和应用前景研究。此外,本文还根据极端微生物的生长优势,初步验证在开放式发酵产胞外多糖方面的可行性。主要内容和结果如下:（1）本文通过高盐筛选培养基和苯酚硫酸法从湖南腊肉和青岛胶州湾海水中共获得2株高产胞外多糖的菌株LR-1和HS-5。随后通过菌株的表型特征、生理生化特征和分子生物学确定了LR-1和HS-5均是革兰氏阳性的长杆状细菌,它们均能够耐受160 g/L Na Cl。LR-1和HS-5的最适Na Cl浓度是0 g/L和40 g/L,分别属于极端耐盐和中度嗜盐细菌。根据16S r RNA鉴定,将LR-1和HS-5分别命名为Bacillus subtilis LR-1（简称B.subtilis LR-1）和Bacillus sp.HS-5。（2）获得了来自腊肉的极端耐盐菌B.subtilis LR-1在含有20 g/L Na Cl发酵液中产生的胞外多糖,并研究了胞外多糖的分离纯化和醇沉优化条件。首先,通过离心、Sevage法、乙醇沉淀、透析、无水乙醇和丙酮洗涤过程从发酵液中提取到粗多糖（BL）。之后,以单因素和响应面实验对BL醇沉工艺进行了优化,确定了最佳条件:提取温度为4℃,醇沉浓度为80 m L/d L,提取时间为12 h,粗多糖得率最大（53.4g/L）。最后,粗多糖经柱纯化获得主要纯化组分BL-P1。（3）通过涂布平板法和微生物群落分析,研究了来自胶州湾海水的中度嗜盐菌Bacillus sp.HS-5开放式发酵的可行性。以不同Na Cl浓度的发酵培养基确定HS-5的开放式发酵条件,最终确定的条件为:50 g/L葡萄糖、10 g/L酵母浸粉、20 g/L蛋白胨、90 g/L Na Cl、10%接种量。之后,开放式发酵液中的粗多糖以结果（2）所述流程进行提取纯化,并获得了两个主要纯化组分BH-1和BH-2。（4）初步研究了BL-P1、BH-1和BH-2的结构组成。通过液相色谱（HPLC）、凝胶渗透色谱（HPGPC）、傅里叶红外光谱（FT-IR）和核磁（NMR）分析了纯化多糖的结构。BL-P1的单糖组成主要是葡萄糖和甘露糖,二者所占比为Glc:Man=7:1;该多糖是一种多支链的杂多糖,平均分子量（Mw）为41.11 k Da;组成多糖链的残基主要包括:1,4,6-α-D-Glcp、1,4-β-D-Glcp、1,2-α-D-Manp、1,3-β-D-Glcp和不同位置的两种T-α-D-Glcp。BL-P1可能含有→4,6)-α-D-Glcp-（1→4）-β-D-Glcp-（1→的主链骨架。BH-1的单糖组成和BL-P1相似（Glc:Man=7:1）,Mw为41.6 k Da;单糖残基包括T-α-D-Glcp、T-α-D-Manp-（1-OH）、1,6-α-D-Glcp和1,3-β-D-Glcp,存在→6）-α-D-Glcp-（1→3）-β-D-Glcp-（1→的长链结构。BH-2主要是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖组成（Man:Rha:Glc A:Glc=1:1:1:2）的杂多糖,Mw为22.6 k Da。BH-2结构比BH-1复杂,组成多糖链的残基主要有:1,2-α-D-Manp、1,2,6-α-D-Manp、1,2-α-L-Rhap、T-β-D-Glcp A、1,4-β-D-Glcp、1,3-β-D-Glcp和1,6-β-D-Glc,可能以→2,6）-α-D-Manp-（1→2,6）-α-D-Manp-（1→方式构成主链。（5）通过体外实验,研究了BL-P1、BH-1和BH-2在抗氧化、流变性、絮凝性或α-淀粉酶抑制性方面的应用潜力。BL-P1在抗氧化和流变性方面具备应用优势。BL-P1对DPPH（77.65%）和羟基自由基（93.23%）有强的清除能力。BL-P1水溶液良好的流变能力体现在:1）在先加热和后逐渐冷却的循环过程中以及在高盐条件（Na Cl和Ca Cl2）下呈流变稳定性;2)与结冷胶溶液按1:1（v/v）复配的混合液表现明显的协同增稠作用。而BH-1和BH-2的水溶性和持水能力突出,是一种极易溶于水的非凝胶化多糖。BH-1和BH-2絮凝性不显著,但都具备一定的α-淀粉酶抑制活性（32.98±2.85%,37.05±3.98%）。（6）通过热重、扫描电镜和X射线研究了开放式发酵多糖BH-1和BH-2的形态特征。BH-1是一种部分结晶多糖,多糖表面粗糙,有大小不一、边缘平整的孔洞;BH-2是一种非晶或半晶结构,表面呈光滑的薄膜形貌。在温度从30℃升至700℃时,BH-1比BH-2更具备耐热特性,它们重量损失分别在25%和53%。综上,鉴于极端微生物可能具备产生新型多糖的潜力,本文从高渗透压的盐环境下筛选到了两株耐（嗜）盐细菌B.subtilis LR-1和Bacillus sp.HS-5。在此基础上进行高盐培养基发酵产多糖。之后,分别详细介绍了胞外多糖提取纯化流程、提取工艺优化、结构和应用潜力,进一步丰富了耐（嗜）盐菌株胞外多糖的信息。而且,BL-P1的高抗氧化能力和凝胶性质,具备作为抗氧化剂和食品等添加剂的应用潜力。BH-1和BH-2在α-淀粉酶抑制方面表现出一定的应用优势,具备作为降糖产品的应用潜力。此外,本文还验证了中度嗜盐的Bacillus sp.HS-5进行开放式发酵的可行性,为微生物开放式发酵产多糖奠定基础。