TGF-β1调控骨髓微环境介导FLT3-ITD阳性急性髓系白血病耐药研究

来源 :南方医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qingsong009
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研究背景:急性髓系白血病(AML)是一种常见血液系统恶性肿瘤,其中30%患者伴有FMS样的酪氨酸激酶3(FLT3)突变,包括FLT3近膜区内部串联重复突变(ITD)和“活化环”处点突变(TKD)。目前AML的治疗以化疗为主,诱导化疗可以使80%左右的初发患者获得完全缓解(CR),但仍有大部分患者缓解后复发,并最终演变成难治性白血病。究其原因,可能与AML细胞耐药关系密切,耐药不仅与白血病细胞自身的生物特性相关,而且与白血病细胞外部环境有关。研究发现,FLT3-ITD突变不仅参与白血病的发生发展,而且通过诱导RUNX3介导化疗耐药。传统方案治疗FLT3-ITD突变阳性(FLT3-ITD+)AML总生存(OS)低、复发率高,高强度化疗无法使该亚型患者获益,异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)也难以改善部分患者的预后。米哚妥林(Midostaurin)是新型FLT3酪氨酸激酶抑制剂(TKI),2017年被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗FLT3阳性AML。与传统化疗方案相比,Midostaurin联合化疗可以提高FLT3+AML患者4年OS(44.3%提高至51.4%),但不能提高缓解率(CR)以及ITD(high或low)亚组OS,疗效仍有限。TKI联合化疗可以清除FLT3-ITD+AML敏感克隆,但化疗药物克隆选择性压力下耐药克隆的出现、信号通路旁路活化、骨髓微环境的化疗保护及白血病干细胞(LSC)的存活与白血病复发耐药关系密切。目前认为,骨髓微环境诱导FLT3-ITD+AML耐药和支持LSC存活是微小残留(MRD)不能被彻底清除、白血病复发的根本原因,机制尚不完全清楚。因此,缺乏克服微环境介导耐药的有效方法。深入研究骨髓微环境调控FLT3-ITD+AML耐药机制,为靶向干预提高疗效奠定理论基础。转化生长因子β1(TGF-β1)是骨髓微环境中重要的细胞因子之一,在调控AML细胞及LSC自我更新及细胞周期中起重要作用。在多种实体肿瘤中,TGF-β1表达异常与肿瘤发生、转移及耐药关系密切。但是,TGF-β1在AML耐药中的作用及机制尚不明确。研究目的:1.检测AML患者来源的骨髓间充质干细胞(骨髓MSC)分子生物学改变,分析与AML患者基因改变的相关性。2.检测TGF-β1在健康供者、初发及缓解后AML患者骨髓液表达水平,分析不同AML疾病阶段及亚型的差别,探讨与临床疗效的相关性。3.研究TGF-β1在骨髓微环境诱导AML耐药中的作用及机制。研究内容及方法:1.收集30例健康供者、80例AML患者初诊及缓解后骨髓进行MSC培养及鉴定。2.检测17例AML患者骨髓MSC分子生物学改变,分析与AML患者基因改变的相关性。3.采用ELISA方法检测TGF-β1在健康供者、初发及缓解后AML患者骨髓液表达及亚型分布,采用SPSS软件分析骨髓TGF-β1表达AML患者的临床特征及化疗疗效的关系。4.骨髓微环境对FLT3-ITD阳性急性髓系白血病细胞株Molm13索拉菲尼(sorafenib)敏感性的影响:在体外用AML患者来源骨髓MSC与Molm13细胞共培养,模拟骨髓微环境,采用CCK8检测索拉菲尼对Molm13细胞增殖的影响;利用流式细胞术检测索拉菲尼诱导Molm13细胞凋亡情况。对比研究骨髓微环境对FLT3-ITD阳性急性髓系白血病细胞索拉菲尼敏感性的影响。5.TGF-β1对FLT3-ITD 阳性急性髓系白血病细胞株Molm13索拉菲尼敏感性的影响:在体外共培养体系及非共培养体系中加入TGF-β1及TGF-β1联合其受体抑制剂LY2109761,利用CCK8检测增殖、流式检测凋亡,分析TGF-β1对Molm13细胞索拉菲尼敏感性的影响。6.统计分析:应用SPSS 23.0和GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析,两组计量资料比较采用t检验,多组均数比较用单因素方差分析,P值<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果:1.检测17例初发AML患者骨髓来源MSC,研究发现:骨髓MSC不具有AML特异性分子生物改变。2.检测健康供者及AML患者TGF-β1表达发现:初发AML患者骨髓液TGF-β1水平明显低于健康供者(P=0.0027);缓解后AML患者TGF-β1水平明显高于初发患者(P<0.0001),其中初发AML患者中低危组患者骨髓液TGF-β1蛋白水平明显高于高危组患者(P=0.004),但是在性别、年龄、染色体核型、是否为难治病例、白细胞计数、是否伴有FLT3-ITD突变和是否存在CEBPA突变、是否缓解等不同临床生物学特征亚组之间不存在统计学差异(P值分别为0.966、0.156、0.081、0.872、0.593、0.199、0.707、0.347)。Q-PCR 检测骨髄 MSC 的TGF-β1 mRNA表达水平,初发AML患者及缓解后患者与正常供者TGF-β1 mRNA表达无统计学差异(P=0.6225)。3.利用CCK-8检测索拉菲尼对Molm13细胞增殖的影响,结果显示,不同浓度索拉菲尼对Molm13细胞具有生长抑制作用,随处理药物剂量增加,细胞增殖抑制率提高,呈明显的剂量依赖关系。利用不同浓度索拉菲尼处理Molm13细胞24h、48h、72h,与非共培养相比,共培养体系中Molm13细胞对索拉菲尼的敏感性明显下降(P=0.0013;P=0.0008;P=0.003)。4.rhTGF-β1对Molm13细胞索拉菲尼药物敏感性的影响:在非共培养体系与共培养体系中加入rhTGF-β1,检测rhTGF-β1对Molm13细胞索拉菲尼敏感性的影响,研究发现rhTGF-β1能够增加索拉菲尼对Molm13细胞的增殖抑制作用(P=0.0305),同时加入TGF-β1受体拮抗剂LY2109761,可以逆转TGF-β1的增敏效应(P=0.0444)。与非共培养相比,共培养模体系中,rhTGF-β1增加Molm13细胞索拉菲尼药物敏感性更明显(P=0.0104),LY2109761同样可以逆转这种效应(P=0.0071)。流式细胞检测结果显示,在非共培养及共培养体系中,rhTGF-β1可以提高索拉菲尼对Molm13细胞的诱导凋亡作用(P=0.0031)。结论:1.AML患者骨髓来源MSC不遗传AML特异性分子生物学改变。2.初发AML患者骨髓上清TGF-β1表达水平的明显低于正常供者以及缓解后AML患者。3.索拉菲尼对Molm13细胞具有明显的增殖抑制作用,体外MSC共培养模拟骨髓微环境,共培养后Molm13细胞对索拉菲尼的敏感性降低。4.TGF-β1可以明显增加Molm13细胞对索拉菲尼的敏感性,其受体抑制剂可以抑制TGF-β1对Molm13细胞的增敏作用。
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