【研究背景】银屑病(psoriasis)是一种常见、易复发、难以根治的慢性炎症性增生性疾病,是与多基因遗传、免疫、感染等多因素相关的复杂病变过程。根据其临床表现可以分为寻常型、脓疱型、关节病型和红皮病型。该病复发性高,严重影响患者的生活质量,发病机制尚未完全清楚,仍是皮肤科的重点研究的疾病之一。目前普遍认为,银屑病的发病是具有遗传易感性的个体在外界环境刺激下发生免疫功能紊乱引起,角质形成细胞增殖和分化异常,真皮血管形成增多,活化的角质形成细胞可产生炎症细胞因子和趋化因子,导致免疫细胞的聚集和活化,进而发生慢性炎症反应。微小RNAs(micro RNAs,miRNAs)是长度约22-25个核苷酸的微小RNA,位于基因组的非编码区,负责转录后水平的调控,通过与目的基因mRNA的3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)互补结合,从而使目的基因的mRNA降解或翻译受到抑制。近年来的研究发现,miRNAs在一些慢性炎症性疾病和肿瘤的发病机制中起到了重要作用,参与机体免疫应答的调节,与相关炎症因子及血管生成因子的表达密切相关。而银屑病的发病过程中,伴随着炎症反应及真皮乳头血管的生成,miRNAs与银屑病的发病机制可能有着密切的关系。此外,至今为止,已发现超过250种miRNAs在银屑病患者外周血或皮损中异常表达。微小RNA-146(miR-146)是在银屑病患者外周血中异常表达的miRNAs之一,大多数的脊椎动物有两个编码miR-146的基因,分别为miR-146a和miR-146b,而人类miR-146a是miR-146家族中被研究最多的一员。近年多项研究发现,miR-146a在调节免疫、炎症反应、血管生成等方面均发挥了重要作用。miR-146a与银屑病发病机制之间的关系未完全清楚,本课题组前期对miR-146a与银屑病中免疫介导的炎症做了相关研究,现主要研究miR-146a影响银屑病发病中血管生成的作用机制。通过生物预测软件我们发现miR-146a有多个靶基因,其中包括FADD、TRAF6、IRAK1、EGFR、Smad4等,miR-146a通过与靶基因相互作用,广泛参与人体各种生理活动及疾病的发生发展。其中,miR-146a与Smad4(Smads蛋白家族之一)基因结合,可在转录后水平抑制Smad4的表达。Smad4为TGF-β/Smads信号通路中必不可少的中转分子,TGF-β的功能表现在制角质形成细胞的增殖、维持表皮内环境的稳定。Smad4表达水平的下降,可影响TGF-β/Smads信号传导通路,阻断TGF-β信号对角质形成细胞过度增殖的抑制,导致角质形成细胞增多,受银屑病相关炎症因子如IL-17等的刺激,增生的角质形成细胞分泌VEGF等相关促血管生成的因子相应增加,进而使真皮乳头毛细血管增多,血管通透性增加,加重真皮炎症反应。本课题组成员在前期的研究中发现:miR-146a在寻常型银屑病患者的外周血单个核细胞及皮损中表达升高,并且与患者的疾病分期相关。Smad4是TGF-β/Smads信号传导通路的中转分子,也是miR-146a的一个重要靶基因,因此,我们推测miR-146a可能与Smad4结合,直接参与银屑病的角质形成细胞过度增殖,也可能通过调控Smad4下游相关因子如VEGF的表达,从而参与银屑病的炎症反应及促血管生成发病过程,促进银屑病的发生和发展。【方法】1.随机选择寻常型银屑病患者,取患者身上斑块型皮损部位的皮肤,以正常人皮肤作为对照组。采用免疫组化法,将结果用Image Pro-Plus(IPP)图像处理系统进行半定量分析,测定灰度值后取平均值,反映标本相应蛋白的表达强度。2.双荧光素酶法测定人胚肾细胞细胞共转染含Smad4有效结合片段的质粒和miR-146a mimics后的荧光素酶的活性。3.培养人永生化表皮细胞系(Ha Cat细胞),分别转染miR-146a类似物和抑制物,模拟miR-146a的过表达和表达抑制,通过RT-PCR法检测各组Smad4及VEGF的表达水平。4.培养Ha Cat细胞,分别转染Smad4干扰片段si RNA(small-interference RNA)和空白片段、阴性对照片段,用一定浓度IL-17刺激后,Western Blot法分别检测Smad4和VEGF的蛋白表达水平。【结果】1.寻常型银屑病患者皮损中Smad4的表达水平低于正常对照组(t1=3.61,P<0.05)、而VEGF的表达水平高于健康对照组(t2=-5.42,P<0.05),差异具有统计学意义。皮损中Smad4的表达水平与患者PASI评分呈负相关、VEGF表达水平与患者PASI评分呈正相关(r1=-0.719,P<0.01,r2=0.794,P<0.01)2.含野生型Smad4 3’-UTR的报告系统miR-146a的异位表达减少,荧光素酶活性显著降低,Smad4为miR-146a的一个有效结合靶点。(P<0.05)3.培养Ha Cat细胞,过表达miR-146a可有效抑制靶基因Smad4的表达,且促进VEGF的表达。而miR-146a表达抑制后对下游靶基因Smad4并无明显改变。4.Ha Cat细胞转染si RNA后用Western Blot法检测显示,Smad4蛋白表达明显低于阴性对照,VEGF蛋白的表达则高于对照组。【结论】1.寻常型银屑病患者皮损中Smad4异常表达下降,且与患者PASI评分呈负相关;VEGF表达升高,与患者PASI评分呈正相关。提示Smad4与VEGF可能反向协同促进银屑病的发生和发展,这两者表达水平可作为寻常型银屑病严重程度的判断指标之一。2.Smad4是miR-146a的靶基因之一,可与miR-146a特异性结合。3.miR-146a可在转录水平抑制靶基因Smad4的表达,进而促进VEGF的表达。4.miR-146a可能通过靶基因Smad4在翻译水平实现对VEGF的表达调控,Smad4的减少能有效促进VEGF的表达,提示Smad4在银屑病的血管生成中起负性调节作用。