研究背景和目的氧是维持生命活动必不可少的物质,各种原因导致的机体供氧不足或用氧障碍,都可导致缺氧。作为以有氧代谢为主的组织,脑对缺氧的耐受性差,对缺氧极为敏感,急性严重缺氧在数分钟内即可引起脑神经元的不可逆性损伤甚至死亡,长期慢性缺氧也可引起中枢神经系统的功能紊乱和病理结构改变。因此寻找防治低氧性神经损伤,提高脑对低氧耐受性的措施,对于增强机体适应低氧环境的能力及防治临床缺氧性疾病具有重要意义。低氧预适应(hypoxia preconditioning,HPC)是体内一种内源性保护现象,通过亚致死性低浓度氧反复短暂刺激细胞或组织,使其对随后更严重的缺氧产生耐受,从而产生保护作用,广泛存在于心、脑、肾、肝、肠等器官中。作为内源性保护机制这一现象的发现为增强机体适应低氧环境的能力及防治缺氧性损伤提供了全新的思路。本实验室既往的研究发现(1)HPC对小鼠海马神经元有明显的保护作用,能显著提高小鼠的学习记忆能力,证实HPC具有显著的抗缺氧/缺血神经损伤作用;(2)急性重复低氧预适应发生发展过程中随着小鼠低氧暴露次数的增加其缺氧耐受时间逐渐延长,重复低氧暴露2次、3次和4次的缺氧耐受时间分别是低氧暴露1次耐受时间的2、4、6倍,推测重复低氧暴露后小鼠体内产生了抗缺氧活性分子,且随着缺氧次数的增加,抗缺氧活性分子的数量也在增加,存在着与药物作用类似的剂量-效应关系,从而导致小鼠的缺氧耐受时间逐步延长;(3)通过建立急性重复缺氧HPC小鼠模型,发现HPC组的脑组织匀浆液具有显著抗缺氧神经损伤作用,其中蛋白组分和非蛋白组分均可以显著增强神经生长因子(nerve growth factor,NGF)诱导分化的PC12细胞的缺氧耐受性,提示小分子代谢物在其中发挥重要的作用,但是具体是哪些活性物质在低氧预适应形成过程中发挥抗缺氧损伤的作用尚不清楚。代谢组学是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量(<1000KDa)代谢产物同时进行定性和定量分析的一门学科,反映机体对外界刺激、病理生理变化及本身基因突变而产生的体内代谢物水平多元动态变化。作为各种“组学”的终端,代谢组学更能直接、准确地反应当前机体的病理生理状态。本研究的目的在于通过建立急性缺氧HPC小鼠模型,利用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOFMS)的代谢组学技术,分离鉴定HPC小鼠与对照组小鼠海马、血清中差异代谢物,并对部分结果进行验证,在此基础上进一步探讨机体如何适应缺氧环境以及HPC潜在的保护机制。方法第一部分:低氧预适应小鼠海马代谢组学研究1.60只雄性BALB/C小鼠随机分为3组,常氧对照组(H0),低氧暴露1次组(H1),重复低氧暴露4次组(HPC),每组20只,;按文献报道复制急性缺氧HPC小鼠模型,麻醉,断头取海马组织。海马组织样本均随机分为2份,1份用于生化指标测定,一份用于代谢组学分析。代谢组学分析利用UPLC-Q-TOFMS技术结合多变量统计分析筛选各组差异代谢物,Metabo Analyst3.0数据库进行代谢通路富集分析;2.部分代谢组学结果的验证,分别检测各组小鼠海马组织中SOD活性、MDA和乳酸含量。第二部分:低氧预适应小鼠血清代谢组学研究1.按照相同的动物分组和方法复制HPC小鼠模型,麻醉,眼眶采血法取血并分离血清。血清样本均随机分为2份,1份用于生化指标测定,一份用于代谢组学分析。代谢组学分析采用UPLC-Q-TOFMS结合多变量统计分析筛选各组小鼠血清差异代谢物,Metabo Analyst3.0数据库进行代谢通路富集分析;2.检测各组小鼠血清中SOD活性、MDA和乳酸含量,验证部分代谢组学结果。结果1.小鼠海马组织代谢组学研究共鉴定出37种差异代谢物,与H0组相比HPC组中多巴胺、腺苷、苯丙氨酸、牛磺酸等代谢物显著上调,5-甲基胞苷、谷氨酸、谷氨酰胺、乙酰胆碱、胞苷、NADH、2-羟戊二酸、尿酸、花生四烯酸、油酸、亚油酸、软脂酸、溶血磷脂酰胆碱、谷胱甘肽等代谢物在H1组升高,HPC组降低,而色氨酸、鞘氨醇、黄嘌呤则在H1和HPC组均降低。这些代谢物涉及的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,花生四烯酸代谢,亚油酸代谢,酪氨酸代谢,甘油磷脂代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,色氨酸代谢,苯丙氨酸代谢和三羧酸循环等代谢通路发生显著变化;2.HPC组小鼠海马组织中SOD活性升高,较H0、H1组均有统计学差异;与H0组相比,H1组、HPC组小鼠海马组织中MDA和乳酸含量均升高,且数据均有统计学差异;与H1组相比,HPC组小鼠海马组织中MDA和乳酸含量显著降低;3.小鼠血清代谢组学研究共筛选鉴定出25种差异代谢物,其中缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、牛磺酸在HPC组中显著升高,长链肉毒碱、蛋氨酸、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱、尿酸相对含量在H1组中升高HPC组中降低,这些代谢物涉及的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成,牛磺酸、亚牛磺酸代谢,亚油酸代谢,花生四烯酸代谢等代谢通路均发生显著变化;4.与H0组相比,H1组和HPC组小鼠血清中SOD活性均升高,且HPC组最高,每两组之间数据比较均有统计学差异;与H0组相比,H1组、HPC组小鼠血清中MDA和乳酸含量均升高,且数据均有统计学差异;与H1组相比,HPC组小鼠海马组织中MDA和乳酸含量显著降低。全文结论1.HPC小鼠血清、海马组织代谢模式发生显著改变,其中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成,牛磺酸、亚牛磺酸代谢,花生四烯酸代谢,亚油酸代谢,苯丙氨酸代谢,酪氨酸代谢通路为共同发生改变的代谢通路,谷胱甘肽代谢,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢仅在海马组织中有显著变化,上调(抑制)其中的关键代谢酶或许能提高全身或中枢神经系统抗缺氧损伤能力;2.代谢组学数据中与清除氧化自由基有关的物质谷胱甘肽、尿酸等代谢物变化和小鼠海马组织和血清中反映机体氧化应激状态的SOD活性和MDA含量改变,均提示抗氧化应激损伤可能是HPC抗缺氧保护作用潜在的作用靶点;3.无论小鼠血清还是海马组织代谢组学数据均显示涉及葡萄糖有氧氧化、脂肪酸β氧化的中间代谢物在H1组中均有不同程度的积聚,通过测定小鼠血清、海马组织中乳酸含量,提示改变机体能量代谢模式参与低氧预适应抗缺氧损伤的形成。