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睾丸间质细胞（Leydig Cell,LC）是雄性个体雄激素的主要来源,雄激素对男性生殖系统的发育及男性生殖功能的维持具有决定性作用。DNA甲基化是核酸表观遗传修饰的主要表现方式之一,能在转录水平上调控靶标基因的表达。到目前为止,尚未有研究在表观遗传方面对LC雄激素合成通路关键酶的表达及对雄激素分泌调控方面进行报道。本研究首先分离不同发育阶段的睾丸间质祖细胞（PLC）、睾丸间质未成熟细胞（ILC）以及睾丸间质成熟细胞（ALC）,同时以大鼠尾部成纤维细胞（TTF）作为对照,利用转录组测序RNA-seq技术和基因组甲基化测序RRBS技术相结合的方法,分析不同发育阶段LC细胞转录水平的变化和基因组DNA甲基化图谱差异,探索在LC发育过程中基因组DNA甲基化对雄激素合成通路关键酶基因表达的表观遗传调控机制,为了解LC谱系发育过程、雄激素合成调控机制及日后利用成体细胞重编程为具有功能的类睾丸间质细胞提供科学依据。本研究的主要结果如下:1、对不同发育阶段的LC（PLC、ILC、ALC）及TTF 8个样本（2个重复）进行转录组测序,最终平均各样本获得6.60Gb数据。共检测出15852个基因在LC中表达,其中10636个基因在三个发育阶段的LC中共表达,710个基因在各发育阶段的LC中均差异表达（|log2FC|≧1,FDR﹤0.01）,GO功能注释和富集分析显示,显著富集到与类固醇合成相关的生物过程（p﹤0.05）包括:脂质运输（GO:0006869）、激素代谢过程（GO:0042445）、类固醇代谢过程（GO:0008202）、胆固醇运输（GO:0030301）、睾丸激素反应（GO:0033574）和脂质分解代谢过程（GO:0016042）,其中涉及到与类固醇生成调节相关的基因有:Cyp11a1,Hsd11b1及Tspo。KEGG富集分析结果显示,与类固醇合成相关的通路（p﹤0.05）包括类固醇激素生物合成（rno00140）、胆固醇代谢（rno04979）、细胞色素P450对异生素的代谢（rno00980）。LC和TTF细胞中共检测出28365个基因,共有13446个基因在LC和TTF中共同表达,分别检测出7707、9850和8659个基因在TTF vs PLC、TTF vs ILC和TTF vs ALC三组比较中差异表达（|log2FC|≧1,FDR﹤0.01）,其中有4913个基因均在三组比较中差异表达,GO功能注释和富集分析显示,差异基因发生显著富集与类固醇合成相关的生物过程（p﹤0.05）包括:发展主要的男性性特征（GO:0046546）、性腺发育（GO:0008406）、性别分化（GO:0007548）、Leydig细胞分化（GO:0033327）、类固醇生物合成过程（GO:0006694）、对促性腺激素的反应（GO:0034698）、类固醇代谢过程（GO:0008202）等,其中涉及到与类固醇生成调节相关的基因有:Nr0b1,Ar,Cyp11a1,Cyp17a1,Gata4,Nr5a1,Wt1,Star,Hsd17b3,Hsd3b1及Lhcgr。KEGG pathway富集分析显示,与类固醇合成相关的通路（p﹤0.05）有:皮质醇合成和分泌（rno04927）、细胞因子-细胞因子受体相互作用（rno04060）、MAPK信号通路（rno04010）、细胞色素P450对异生素的代谢（rno00980）和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（rno04933）等,其中涉及到与类固醇生成调节相关的基因有:Nr5a1,Cyp11a1,Hsd3b1,Star及Nr0b1。2、运用RRBS技术构建LC和TTF的基因组DNA甲基化图谱,揭示了两者基因组DNA甲基化特征:mCpG为LC和TTF主要的基因组DNA甲基化方式;mCpG类型甲基化水平在转录起始位点（TSS）附近显著下降,而在基因本体区显著升高;不同功能元件甲基化水平分析显示,promoter区甲基化水平最低。不同发育阶段的LC甲基化组比较（PLC vs ILC、ILC vs ALC、PLC vs ALC）,分别检测出5749、5710和6317个差异甲基化区域（DMR）,关联到3936、3914和4286个差异甲基化基因,其中分别有512、638和654个基因的转录水平变化与甲基化水平变化呈负相关。三个比较组的DMR集中分布于110号及X染色体,极少分布于Y染色体。DMR集中分布于基因间区,部分分布在基因内含子区,少部分分布于基因promoter区。三种LC分别与TTF比较（TTF vs PLC、TTF vs ILC、TTF vs ALC）,分别检测出20254、23275和22169个DMR,关联到8640、9445和9167个基因,其中分别有2160、2570、2509个基因的转录水平变化与甲基化水平变化呈负相关。三个比较组的DMR集中分布于110号及X染色体,极少分布于Y染色体。DMR分布趋势与LC谱系相似,多数DMR集中分布于基因间区,部分分布于基因内含子区,少部分分布于基因promoter区。3、甲基化组与转录组联合分析显示,LC不同发育阶段两两比较获得转录水平变化与甲基化水平变化呈负相关的基因,进行GO功能注释和富集分析,差异基因显著富集与类固醇合成相关的生物过程（p﹤0.05）包括:泌尿生殖系统发育（GO:0001655）、对促性腺激素的反应（GO:0034698）、性腺发育（GO:0008406）、性别分化（GO:0007548）等,其中涉及到与类固醇生成调节相关的基因有:Nr2f2,Nr0b1,Pdgfra,Wt1,Cyp11a1及Notch1,其中,Nortch1的差异甲基化区域发生在promoter区,初步认为是由promoter区甲基化介导的差异表达候选基因。TTF分别与PLC、ILC、ALC两两比较,获得转录水平变化与甲基化水平变化呈负相关的基因,进行GO功能注释和富集分析,差异基因显著富集与类固醇合成相关的生物过程（p﹤0.05）包括:男性性腺发育（GO:0008584）、男性性别分化（GO:0046661）、应激激活的MAPK级联（GO:0043410）、泌尿生殖系统发育（GO:0001655）、性腺发育（GO:0008406）、转录激活因子活性、RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性结合（GO:0001077）等,其中涉及雄激素合成的基因有:Nr5a1,Hsd17b3,Lhcgr,Cyp11a1及Nr0b1,初步认为是由甲基化介导的差异表达候选基因。对差异基因进行KEGG pathway富集分析,差异基因显著富集与类固醇合成相关的通路（p﹤0.05）有:类固醇生物合成过程的调节（GO:0050810）、应激激活的MAPK级联（GO:0051403）、对促性腺激素的反应（GO:0034698）、对cAMP的反应（GO:0051591）、男性性腺发育（GO:0008584）、性腺发育（GO:0008406）、性别分化（GO:0007548）和C21-类固醇激素代谢过程（GO:0008207）等,其中涉及到与类固醇生成调节相关的基因有:Nr5a1,Cyp11a1,Cyp17a1,Cyp21a1及Lhcgr。其中,Nr5a1和Hsd17b3的差异甲基化区域发生在启动子区,初步认为是由promoter区甲基化介导的差异甲基化雄激素合成功能基因。