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维生素B6(Vitamin B6,VB6)是维持机体正常生理代谢活动所必需的重要营养素,其主要的生物活性形式为磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP),参与体内氨基酸、糖原、神经递质、鞘磷脂、血红素和核酸的合成与代谢。吡哆醛激酶(Pyridoxal kinase,Pdx K)和磷酸吡哆醇氧化酶(Pyridoxine 5’-phosphate oxidase,PNPO)是PLP的合成酶,在磷酸酶的共同作用下调节着细胞、血浆和组织内PLP的动态平衡。细胞内PLP的缺乏会引起严重的神经系统疾病,而过量的PLP会对机体产生毒性作用,导致运动和感觉神经出现障碍。因此,细胞内Pdx K和PNPO的活性必须受到严格调控,以满足新合成的缺辅基酶对PLP的动态需求。Pdx K和PNPO的活性调节可以发生在结构水平上,也可以发生在合成水平上。目前,研究人员已从大肠杆菌、植物、昆虫和哺乳动物中鉴定出Pdx K和PNPO,阐明了Pdx K和PNPO的晶体结构、活性调节机制和不同底物下的酶动力学特征。蛋白质是基因表达的产物,转录水平的调控是基因表达过程中重要的环节。启动子控制着基因转录的起始和频率,是深入理解基因转录调控机制的关键。人Pdx K和PNPO基因已被克隆和鉴定,但对其启动子的研究还未见报道。本研究在生物信息学分析的基础上,克隆和构建人Pdx K和PNPO基因不同长度的启动子荧光素酶报告质粒,分析其活性,确定Pdx K和PNPO基因的转录调控区域。进一步对转录调控区内潜在的顺式作用元件进行了缺失突变分析,为深入研究Pdx K和PNPO基因的转录奠定基础。1.生物信息学预测结果显示,人Pdx K和PNPO基因的转录起始位点分别位于翻译起始位点上游198bp和153bp(标记为+1);综合启动子预测软件的结果,确定人Pdx K和PNPO基因的基本启动子区域为-930~+243和-996~+421,该区域内没有典型的TATA-box和CAAT-box元件,但是在转录起始位点附近含有多拷贝的GC-box和Cp G岛;2.利用Primer Premier 5.0设计特异性引物,以人基因组DNA为模板,PCR扩增PdxK和PNPO基因5’端缺失截短片段,连接到含萤火虫荧光素酶基因的p GL3-basic载体上,构建不同长度的启动子-荧光素酶重组质粒。双荧光素酶试验结果表明,人Pdx K基因的转录调控区域为-665~-443,缺失该区域将导致启动子的活性降低66%。人PNPO基因的转录调控区域为-996~-851和-412~+85,缺失该区域会导致启动子的活性分别降低25.8%和58.1%。3.通过JASPAR和Gene Regulation数据库分析PdxK基因-665~-443转录调控区,发现3个潜在的Sp1和1个USF结合位点;而PNPO基因-996~-851和-412~+85的转录调控区发现多个Sp1、E2F1和USF结合位点。设计特异性引物扩增顺式作用元件依次缺失的片段,连接到p GL3-basic载体,构建缺失突变重组质粒。双荧光素酶试验结果显示,Pdx K基因转录调控区内的Sp1结合位点(-552~-542)对维持其高转录活性起着重要作用,缺失会导致启动子活性降低61.1%;而PNPO基因转录调控区内E2F1(-867~-857)和USF(-69~-59)结合位点是重要的顺式作用元件,缺失将导致启动子的活性分别降低26.7%和32.5%。