论文部分内容阅读
背景先天性白内障是导致儿童失明的主要原因,大约有1/3先天性白内障是遗传性的,其中常染色体显性遗传所占比列较高,遗传性先天性白内障多数是由于基因突变引起的。先天性白内障主要的病理改变为晶状体的发育障碍、晶状体内纤维组织瘢块形成,最终导致晶状体浑浊。研究表明先天性白内障的发生与多种基因的突变有相关性,如晶状体细胞结构相关基因的突变(alpha-,bete-和gamma-crystallins and GJA3/A8,AQPO,BFSP2)和调控晶状体发育相关的转录因子基因突变(PITX3,PAX6,FOXE3,EYA1,MAF和Hsf4)。热休克转录因子4(Hsf4)在新生儿晶状体发育的过程中起关键作用。Hsf4由于剪切方式不同形成不同的转录产物:Hsf4a和Hsf4b。Hsf4a为转录抑制因子,而Hsf4b则为转录激活因子。晶状体中只有Hsf4b这一种活性形式,它主要参与调控小分子热休克蛋白(Hsp25、γ-crystallin、α-crystallin)和纤维骨架蛋白(imentin、filesin)等蛋白的表达。研究发现Hsf4b基因的缺失可导致下游蛋白表达的缺失,如Hsp25、γ-晶状体蛋白中的γ-F,γ-S晶体蛋白等。这些发现都说明Hsf4b是调控晶状体早期发育的一个重要转录因子。Hsf4b受磷酸化、乙酰化、类泛素化、sumo化等的调控。但是,调控Hsf4b转录活性的信号通路以及Hsf4b调控晶状体早期发育的分子机制仍不清楚。我们通过酵母双杂交实验,发现了一个新的与Hsf4相互作用的蛋白BAT1(又名UAP56,56KD,U2AF56-associated protein)。BAT1基因最早从猪克隆出来,它含有9个高度保守的结构域。BAT1蛋白属于DAED-box家族蛋白成员之一,DAED-box家族广泛存在于从细菌到哺乳动物的许多物种中,是一个ATP依赖的RNA解螺旋酶家族,既具有RNA激活的ATP结合和水解活性,又具有ATP依赖的RNA解螺旋活性。BAT1参与RNA的各种代谢过程如:RNA转录、mRNA前体剪接、核糖体和剪接体装配、核质运输、蛋白翻译、mRNA降解及维持mRNA的稳定性等重要生命活动。本研究在小鼠晶状上皮细胞中分析BAT1与Hsf4b的相互作用及细胞内定位,探讨BAT1对Hsf4b调控蛋白的影响,丰富先天性白内障的分子机制,为先天性白内障的早期诊断和治疗提供理论基础。目的探讨BAT1在小鼠晶状上皮细胞中与Hsf4b的相互作用及对Hsf4b下游蛋白表达的调控机理。方法(1)用pwzl-HA、pwzl-HA-Hsf4b、pbabe-HA-BAT1、pwzl-HA-Hsf4b+pbabe-HA-BAT1质粒的逆转录病毒感染hsf4-/-小鼠晶状上皮细胞(mLEC/hsf4-/-),用blasticidin和puromycin筛选,构建细胞稳定株。突变体BAT1K95E、Hsf4b+BAT1K95E质粒的逆转录病毒感染hsf4-/-小鼠晶状上皮细胞(mLEC/hsf4-/-),用puromycin筛选,构建细胞稳定株。(2)应用细胞免疫荧光技术,分析Hsf4b与BAT1亚细胞定位。(3)应用Realtime-PCR方法,分析BAT1对Hsf4b下游基因在mRNA水平的影响,应用免疫印迹(western blotting)实验,分析BAT1对Hsf4b调控蛋白αB晶状体蛋白、hsp25蛋白的表达。(4)应用Luciferase assay实验,检测BAT1对Hsf4b下游基因aB-晶状体蛋白基因启动子的调控。(5)应用细胞核质分离,Realtime-PCR方法,分析BAT1对Hsf4b下游蛋白的核质输出的影响,利用Pull Down实验,探讨Hsf4b是否可以促进BAT1的泛素化。(6)利用BAT1在mRNA水平具有核输出功能,而95位点是其核输出功能的关键位点。构建pbabe-HA-BAT1K95E突变质粒,酶切测序及鉴定突变位点。(7)应用Realtime-PCR方法,分析BAT1基因核输出位点突变对Hsf4b下游基因αΒ在mRNA水平的影响。结果(1)在小鼠晶状上皮细胞mLEC中,BAT1与Hsf4b在细胞核共定位,同时抑制hsf4b的下游蛋白αB基因启动子的转录活性。BAT1对Hsf4b下游蛋白αB、hsp25的表达起下调的作用。(2)根据BAT1的生物学功能进一步分析,BAT1对Hsf4b下游基因aB在核质输出方面无调控作用。同时BAT1对Hsf4b下游蛋白αB的抑制作用不是由于BAT1的核输出起作用,BAT1核输出功能突变后对Hsf4b的下游基因αB在mRNA水平有所下调。同时,Hsf4b不能促进BAT1的泛素化。结论BAT1与Hsf4b在体外相结合,同时在小鼠晶状上皮细胞内共定位于细胞核。BAT1降低Hsf4b下游基因αB、hsp25mRNA水平、减少αB、hsp25蛋白表达,且此作用与BAT1的ATP结合能力无明显关系。