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目的：本课题通过建立APOE-/-小鼠的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)模型，运用超高液相色谱-质谱联用技术（UltraHighPerformanceLiquidChromatography-MassSpectrometer,UPLC-MS/MS）结合临床血生化、组织病理学等技术，观察各组小鼠（正常组，模型组，阿托伐他汀钙组，中药大、中、小剂量组）的尿液代谢特征，确定出能判别各组小鼠之间存在的生物标志物群，探讨其干预作用及可能的代谢调控机制。
方法：
1.实验动物的选择与分组
以高脂饲料喂养APOE-/-小鼠，C57BL/6J野生型小鼠正常饮食，喂养14周。将50只8周APOE-/-小鼠雌雄各半随机分为模型组、阿托伐他汀钙组、中药骐龙血脉健方大剂量组、中剂量组、小剂量组共5组，以及C57BL/6J野生型小鼠10只，雌雄各半，为正常组。正常组、模型组予生理盐水灌胃，阿托伐他汀钙组予阿托伐他汀钙溶液灌胃，中药骐龙血脉健方大、中、小剂量组分别给予该方中药颗粒剂溶液相应剂量灌胃。灌胃时间为14周。
2.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠体重的影响
分别测量第0周、第7周、第14周小鼠的体重，从整体层面观察各组小鼠的一般状态以及药物的治疗效果。
3.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的临床血生化水平
采用生化分析仪检测各组小鼠血脂四项：总甘油三酯（triglyceride,TG）、总胆固醇（totalcholesterol,TC）、高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein-C,HDL-C）、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein-C,LDL-C）。
4.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的组织病理学影响
分别对各组小鼠主动脉进行HE染色、主动脉束油红O染色、油红O染色，通过光学显微镜观察。
5.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的尿液代谢组学研究
应用UPLC-MS/MS进行尿液样品的分离和数据采集，得到各组小鼠的尿液代谢谱。通过Xcalibur4.0软件得到各组小鼠尿液的总离子图，数据采集与分析采用ProgenesisQi软件，将处理好的数据导入EZinfo中进行多变量统计分析，进行有监督的偏最小二乘判别分析（Partialleastsquaresdiscriminantanalysis,PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OrthogonalPartialLeastSquares-DiscriminantAnalysis,OPLS-DA），根据样本的主成分得分作scoreplot图，可判别组间差异对组别进行分类，做散点图（LoadingPlot）可发现显著升高或降低的变量，选择投影变量重要性（VariableImportanceProjection,VIP）＞3的变量为生物标记物，获得变量（rt-mz，即保留时间-质荷比）、分子量（compMW）、观察量（样本）和峰强。搜索HMDB数据库和参考相关文献对导出的化合物进行筛选。最后对鉴定的化合物在IMPaLA界面进行pathway分析。
结果：
1.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠体重的影响
在第0周，模型组与正常组的体重相比较具有显著的差异，差异具有统计学意义（p＜0.01）。是因为在第0周模型组、阿托伐他汀钙组、各中药组小鼠与正常组小鼠虽然都是8周龄，但因为品系不同而具有差异。阿托伐他汀钙组、各中药组与模型组相比，没有差异，不具有统计学意义（p＞0.05）。在第7周，模型组与正常组的体重相比较具有显著的差异，差异具有统计学意义（p＜0.01），由表1、图1可看出模型组小鼠体重增幅明显大于正常组。模型组与阿托伐他汀钙组、中药大剂量组、中药中剂量组相比，具有明显差异性，差异具有统计学意义（p＜0.05）。模型组与中药小剂量组相比，中药小剂量组体重较低，但不具有统计学意义（p＞0.05）。在第14周，模型组与正常组的体重相比较具有显著的差异，差异具有统计学意义（p＜0.01），模型组小鼠体重增幅也明显大于正常组。模型组与阿托伐他汀钙组、中药大剂量组，具有明显差异性，差异具有统计学意义（p＜0.05）。模型组与中药中剂量组、中药小剂量组相比体重逐渐较低，但不具有统计学意义（p＞0.05）。
2.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的临床血生化水平
与正常组相比，模型组小鼠TC、TG和LDL-C的水平明显上升，HDL-C水平明显下降，差异具有统计学意义（p＜0.01）。与模型组相比，阿托伐他汀钙组、中药大剂量和中药中剂量的TC、TG和LDL-C的水平明显上升，HDL-C水平明显下降，差异具有统计学意义（p＜0.01）。与模型组相比，中药小剂量的TG均数减少，但不具有统计学意义（p＞0.05）。
3.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的组织病理学影响
（1）HE染色：正常组：主动脉内膜光滑，无增厚，内膜下无斑块，组织形态正常；模型组：主动脉可见内膜增厚，大量的泡沫细胞；阿托伐他汀钙组：主动脉内膜下可见脂质沉积和少量泡沫细胞；中药大剂量组：主动脉内膜下可见脂质沉积和少量泡沫细胞；中药中剂量组：主动脉内膜下可见内皮细胞剥脱和少量脂质沉积；中药小剂量组：主动脉局部局部内膜可见增厚，脂质沉积，内膜破坏。
（2）主动脉束油红O染色：正常组：主动脉内膜红染程度较其它组轻，未见明显的主动脉脂质点沉积；模型组：主动脉内膜红染最明显，有大量主动脉脂质点沉积；阿托伐他汀钙组、中药大、中、小剂量组：主动脉内膜红染明显，中药小剂量组有大量主动脉脂质点沉积，明显较阿托伐他汀钙组和中药中剂量组多。
（3）主动脉油红O染色：正常组：主动脉内膜下未见明显脂质沉积；模型组：动脉内膜下可见明显的脂质沉积，脂质沉积量最多；阿托伐他汀钙组、中药大、中、小剂量组：各组脂质沉积较正常组明显，但少于模型组。阿托伐他汀钙组和中药大剂量组脂质沉积明显较中剂量和小剂量少，中药中剂量和小剂量可见内膜下散在斑块存在。
4.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的尿液代谢组学研究
（1）代谢组学技术能够将正常组、模型组、阿托伐他汀钙组、中药大剂量组明显区分；
（2）APOE-/-小鼠尿液中PC（14：1（9Z）/24：1（15Z））、菊粉糖、对甲酚葡糖苷酸、硫酸苄酯、假羽扇豆碱的含量上升；泛酸、莽草酸、雌马酚4-O-葡糖苷酸、聚乙二醇、橙皮素3-O-硫酸盐、浅蓝菌素、3Phenylpropionylglycine、染料木黄酮5-O-葡糖苷酸、1,2,4,8四乙酰氧基-7-羟基-3-（4-羟基苯基）二苯并呋喃、邻苯二酚硫酸盐、芹菜素7-硫酸盐、柚皮素4-O-葡糖苷酸、二氢阿魏酸4-硫酸盐、吲哚乳酸、大豆苷元7-O-葡糖苷酸、苯酚硫酸盐、三磷酸、十二烷二酰肉碱、雌马酚7-O-葡糖苷酸、肉桂甘氨酸、Marmesin鼠李糖苷、天冬氨酰天冬酰胺、肉桂酸、4-胍基丁酸、3-羟基十二烷酰肉碱、Hesperetin3-O-葡萄糖醛酸苷、缬氨异亮氨酸、N-乙酰、去氢催吐萝芙木醇的含量下降。
（3）鉴定出了骐龙血脉健方干预APOE-/-小鼠尿液相关的14种潜在标志物。
结论：
1.骐龙血脉健方能够有效降低APOE-/-小鼠的体重、血脂，其中大剂量效果最好。
2.代谢组学技术能够将正常组、模型组、中药大剂量组明显区分；代谢谱的变化能反映出APOE-/-小鼠在骐龙血脉健方大剂量组的干预下使AS更加趋向正常组，远离模型组。
3.模型组小鼠体内存在物质代谢失常，主要表现为PC（14∶1（9Z）/24∶1（15Z））、菊粉糖、对甲酚葡糖苷酸等磷脂类和糖类代谢物的含量上升，4-胍基丁酸、缬氨异亮氨酸等氨基酸的含量相对下降，这些代谢物的变化表明模型组小鼠体内发生了氨基酸代谢、脂质代谢和糖代谢紊乱。
4.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的代谢物主要表现为PC(18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/P-18∶1(11Z))、亚油酸等脂类代谢物含量的下降，Pinostrobin5-glucoside、桃苷、7-羟基-5-甲氧基黄酮等黄酮类代谢物含量的上升，这些代谢物的变化表明主要通过甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢通路的调节来抗AS。
方法：
1.实验动物的选择与分组
以高脂饲料喂养APOE-/-小鼠，C57BL/6J野生型小鼠正常饮食，喂养14周。将50只8周APOE-/-小鼠雌雄各半随机分为模型组、阿托伐他汀钙组、中药骐龙血脉健方大剂量组、中剂量组、小剂量组共5组，以及C57BL/6J野生型小鼠10只，雌雄各半，为正常组。正常组、模型组予生理盐水灌胃，阿托伐他汀钙组予阿托伐他汀钙溶液灌胃，中药骐龙血脉健方大、中、小剂量组分别给予该方中药颗粒剂溶液相应剂量灌胃。灌胃时间为14周。
2.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠体重的影响
分别测量第0周、第7周、第14周小鼠的体重，从整体层面观察各组小鼠的一般状态以及药物的治疗效果。
3.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的临床血生化水平
采用生化分析仪检测各组小鼠血脂四项：总甘油三酯（triglyceride,TG）、总胆固醇（totalcholesterol,TC）、高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein-C,HDL-C）、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein-C,LDL-C）。
4.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的组织病理学影响
分别对各组小鼠主动脉进行HE染色、主动脉束油红O染色、油红O染色，通过光学显微镜观察。
5.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的尿液代谢组学研究
应用UPLC-MS/MS进行尿液样品的分离和数据采集，得到各组小鼠的尿液代谢谱。通过Xcalibur4.0软件得到各组小鼠尿液的总离子图，数据采集与分析采用ProgenesisQi软件，将处理好的数据导入EZinfo中进行多变量统计分析，进行有监督的偏最小二乘判别分析（Partialleastsquaresdiscriminantanalysis,PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OrthogonalPartialLeastSquares-DiscriminantAnalysis,OPLS-DA），根据样本的主成分得分作scoreplot图，可判别组间差异对组别进行分类，做散点图（LoadingPlot）可发现显著升高或降低的变量，选择投影变量重要性（VariableImportanceProjection,VIP）＞3的变量为生物标记物，获得变量（rt-mz，即保留时间-质荷比）、分子量（compMW）、观察量（样本）和峰强。搜索HMDB数据库和参考相关文献对导出的化合物进行筛选。最后对鉴定的化合物在IMPaLA界面进行pathway分析。
结果：
1.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠体重的影响
在第0周，模型组与正常组的体重相比较具有显著的差异，差异具有统计学意义（p＜0.01）。是因为在第0周模型组、阿托伐他汀钙组、各中药组小鼠与正常组小鼠虽然都是8周龄，但因为品系不同而具有差异。阿托伐他汀钙组、各中药组与模型组相比，没有差异，不具有统计学意义（p＞0.05）。在第7周，模型组与正常组的体重相比较具有显著的差异，差异具有统计学意义（p＜0.01），由表1、图1可看出模型组小鼠体重增幅明显大于正常组。模型组与阿托伐他汀钙组、中药大剂量组、中药中剂量组相比，具有明显差异性，差异具有统计学意义（p＜0.05）。模型组与中药小剂量组相比，中药小剂量组体重较低，但不具有统计学意义（p＞0.05）。在第14周，模型组与正常组的体重相比较具有显著的差异，差异具有统计学意义（p＜0.01），模型组小鼠体重增幅也明显大于正常组。模型组与阿托伐他汀钙组、中药大剂量组，具有明显差异性，差异具有统计学意义（p＜0.05）。模型组与中药中剂量组、中药小剂量组相比体重逐渐较低，但不具有统计学意义（p＞0.05）。
2.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的临床血生化水平
与正常组相比，模型组小鼠TC、TG和LDL-C的水平明显上升，HDL-C水平明显下降，差异具有统计学意义（p＜0.01）。与模型组相比，阿托伐他汀钙组、中药大剂量和中药中剂量的TC、TG和LDL-C的水平明显上升，HDL-C水平明显下降，差异具有统计学意义（p＜0.01）。与模型组相比，中药小剂量的TG均数减少，但不具有统计学意义（p＞0.05）。
3.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的组织病理学影响
（1）HE染色：正常组：主动脉内膜光滑，无增厚，内膜下无斑块，组织形态正常；模型组：主动脉可见内膜增厚，大量的泡沫细胞；阿托伐他汀钙组：主动脉内膜下可见脂质沉积和少量泡沫细胞；中药大剂量组：主动脉内膜下可见脂质沉积和少量泡沫细胞；中药中剂量组：主动脉内膜下可见内皮细胞剥脱和少量脂质沉积；中药小剂量组：主动脉局部局部内膜可见增厚，脂质沉积，内膜破坏。
（2）主动脉束油红O染色：正常组：主动脉内膜红染程度较其它组轻，未见明显的主动脉脂质点沉积；模型组：主动脉内膜红染最明显，有大量主动脉脂质点沉积；阿托伐他汀钙组、中药大、中、小剂量组：主动脉内膜红染明显，中药小剂量组有大量主动脉脂质点沉积，明显较阿托伐他汀钙组和中药中剂量组多。
（3）主动脉油红O染色：正常组：主动脉内膜下未见明显脂质沉积；模型组：动脉内膜下可见明显的脂质沉积，脂质沉积量最多；阿托伐他汀钙组、中药大、中、小剂量组：各组脂质沉积较正常组明显，但少于模型组。阿托伐他汀钙组和中药大剂量组脂质沉积明显较中剂量和小剂量少，中药中剂量和小剂量可见内膜下散在斑块存在。
4.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的尿液代谢组学研究
（1）代谢组学技术能够将正常组、模型组、阿托伐他汀钙组、中药大剂量组明显区分；
（2）APOE-/-小鼠尿液中PC（14：1（9Z）/24：1（15Z））、菊粉糖、对甲酚葡糖苷酸、硫酸苄酯、假羽扇豆碱的含量上升；泛酸、莽草酸、雌马酚4-O-葡糖苷酸、聚乙二醇、橙皮素3-O-硫酸盐、浅蓝菌素、3Phenylpropionylglycine、染料木黄酮5-O-葡糖苷酸、1,2,4,8四乙酰氧基-7-羟基-3-（4-羟基苯基）二苯并呋喃、邻苯二酚硫酸盐、芹菜素7-硫酸盐、柚皮素4-O-葡糖苷酸、二氢阿魏酸4-硫酸盐、吲哚乳酸、大豆苷元7-O-葡糖苷酸、苯酚硫酸盐、三磷酸、十二烷二酰肉碱、雌马酚7-O-葡糖苷酸、肉桂甘氨酸、Marmesin鼠李糖苷、天冬氨酰天冬酰胺、肉桂酸、4-胍基丁酸、3-羟基十二烷酰肉碱、Hesperetin3-O-葡萄糖醛酸苷、缬氨异亮氨酸、N-乙酰、去氢催吐萝芙木醇的含量下降。
（3）鉴定出了骐龙血脉健方干预APOE-/-小鼠尿液相关的14种潜在标志物。
结论：
1.骐龙血脉健方能够有效降低APOE-/-小鼠的体重、血脂，其中大剂量效果最好。
2.代谢组学技术能够将正常组、模型组、中药大剂量组明显区分；代谢谱的变化能反映出APOE-/-小鼠在骐龙血脉健方大剂量组的干预下使AS更加趋向正常组，远离模型组。
3.模型组小鼠体内存在物质代谢失常，主要表现为PC（14∶1（9Z）/24∶1（15Z））、菊粉糖、对甲酚葡糖苷酸等磷脂类和糖类代谢物的含量上升，4-胍基丁酸、缬氨异亮氨酸等氨基酸的含量相对下降，这些代谢物的变化表明模型组小鼠体内发生了氨基酸代谢、脂质代谢和糖代谢紊乱。
4.骐龙血脉健方对APOE-/-小鼠的代谢物主要表现为PC(18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/P-18∶1(11Z))、亚油酸等脂类代谢物含量的下降，Pinostrobin5-glucoside、桃苷、7-羟基-5-甲氧基黄酮等黄酮类代谢物含量的上升，这些代谢物的变化表明主要通过甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢通路的调节来抗AS。