羊毛硫细菌素(lantibiotics)是由革兰氏阳性菌的核糖体合成并经过翻译后修饰加工的一类抗菌肽。BovicinHJ50是本实验室分离得到的牛链球菌HJ50(StreptococcusborisHJ50)所产生的一种AII类羊毛硫细菌素,其最大特点在于其分子中除含有两个硫醚环外,还存在一个特征性的二硫键,但具体分子结构尚不清楚。　　 为阐明bovicinHJ50的分子结构及研究其结构与功能关系,本论文基于bovicinHJ50生物合成中的修饰机制和加工机制,首次建立了一套通过体内修饰、体外加工来合成并纯化bovicinHJ50及其突变体的半体外合成系统,并在此基础上通过对bovicinHJ50重要结构特征进行定点突变、化学修饰和质谱分析,阐明了bovicinHJ50的分子结构,即分子内硫醚环和二硫键的形成方式,同时还证明了二硫键对bovicinHJ50生物活性的重要性。　　 利用大肠杆菌(E.coli)表达系统,本研究首先表达纯化了bovicinHJ50的加工转运蛋白BovT的蛋白酶结构域(BovT150),在体外重建了BovT150的前导肽切割活性；同时,还在E.coli中共表达了结构基因bovA和修饰基因bovM,并纯化得到经翻译后修饰的前肽BovAm。随后在体外系统中,利用BovT150的蛋白酶活性,在正确的位置切除了BovAm的前导肽,生成了具有活性的bovicinHJ50成熟分子,其分子量和抑菌活性与S.bovis产生的野生型bovicinHJ50完全吻合。这种体内修饰、体外加工的合成方式我们称之为“半体外生物合成(Semi-invitroBiosynthesis,SIVB)”。SIVB利用了大肠杆菌表达系统,采用亲和层析与高效液相色谱相结合的方法分离纯化bovicinHJ50,方法简单、程序简便,得率与从产生菌株中纯化相比也大幅提高近3倍,达约300μg每升发酵液。　　 SIVB方法的建立,为万使地获得bovicinHJ50及其各突变体奠定了坚实基础,避免了繁琐的遗传操作系统的构建及某些特定突变体对细胞的毒性和负面调控效应。通过对结构基因bovA进行定点突变,我们利用SIVB构建并纯化获得了一系列bovicinHJ50分子内环结构破坏的突变体C13A,C21A,C29A和T10A/C32A。使用专一性的巯基烷化试剂N-乙基马来酰亚胺(NEM)对这些突变体进行化学修饰,并经MALDI-TOF质谱鉴定,我们成功阐明了bovicinHJ50分子内的成键情况。结果显示,Thr8和Cys13以及Thr10和Cys32分别形成了两个硫醚键,而二硫键则是由Cys21和Cys29连接形成。对Cys21的定点突变研究结果还显示,该二硫键的形成对于维持bovicinHJ50的抑菌生物活性有着重要的作用。　　 本研究首次建立的半体外生物合成方法,为羊毛硫细菌素及其突变体的合成提供了新的思路,为更好地理解羊毛硫细菌素结构功能关系奠定坚实基础；同时,对羊毛硫细菌素bovicinHJ50分子结构的阐明,丰富了我们对该类细菌素的认识。