随着生物技术的迅猛发展,通过遗传转化创制优异种质,并结合常规育种开展小麦新品种培育已成为小麦育种的新途径。然而,由于小麦愈伤组织再生率普遍偏低,严重影响着转基因技术在小麦遗传改良中的应用。长期以来,关于提高小麦愈伤组织再生率的研究主要集中在高频再生基因型受体材料的筛选及培养体系优化等方面,而从分子角度解析愈伤组织再生机理方面的研究相对较少,为丰富小麦愈伤组织再生基因资源,提高小麦遗传转化效率、揭示小麦再生分子机制,建立高效小麦转基因受体系统,本研究运用电子克隆结合RACE等方法克隆了一个与小麦愈伤组织再生相关的候选基因,并对其相关的分子生物学特性及功能进行了初步的鉴定。本研究共取得了以下主要结果:1、小麦愈伤组织再生相关基因的克隆及序列分析:本实验通过电子克隆结合RACE等方法在小麦品种轮选987中分离到一个与小麦愈伤组织再生相关的候选基因,并将其命名为TaTCP-1,序列分析表明,该基因的cDNA全长为2163bp、其中包含一个1623bp的完整开放阅读框(ORF)、编码540个氨基酸、蛋白分子量约为58KDa、理论等电点PI约为5.4;gDNA全长为5906bp,其中包含13个外显子及12个内含子。2、TaTCP-1基因的原核表达及蛋白纯化:本实验利用大肠杆菌的原核表达系统成功诱导了 TaTCP-1蛋白的表达,并用亲和层析柱法将目的蛋白纯化出来。为后续在蛋白水平进一步研究此基因功能奠定基础。3、TaTCP-1基因的亚细胞定位:本实验成功构建了 TaTCP-1-GFP的融合表达载体,并通过PEG转染法将其转化到拟南芥的原生质体中使其表达,在激光共聚焦显微镜下观察到在细胞核,细胞质及细胞膜上均存在TaTCP-1蛋白。4、TaTCP-1基因的表达特性分析:实时荧光定量(qRT-PCR)结果表明,该基因具有组织表达特异性,在愈伤中表达量最高;在愈伤形成阶段,随诱导时间的延长,其表达量逐渐上升,当诱导11d时表达量达到峰值,随后呈下降趋势;此外,TaTCP-1基因在胚性愈伤组织中的表达量高于非胚性愈伤组织。5、转基因功能分析:本实验成功构建了 pWMB003-TaTCP-1超表达载体及pAHC25-RNAi-TaTCP-1干扰表达载体,并通过基因枪法将其与空载体对照分别转化到济麦22和轮选987两个再生率不同的小麦品种中。T0代共得到720株抗性植株,PCR检测结果显示,74株为转基因植株,T1代转基因植株的愈伤组织再生率统计结果表明:转TaTCP-1超表达的小麦愈伤组织再生率为35.54%,比对照(21.11%)提高了 14.43%;转TaTCP-1RNAi的小麦愈伤组织再生率为63.22%,比对照(148.31%)降低了 85.09%,说明TaTCP-1基因对再生有一定的促进作用。