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目的:口腔是一个有菌环境,牙周组织时刻受到各种病原微生物的挑战,随之引发的宿主免疫炎症反应可极大地影响组织细胞正常的生理功能。除了微生物影响外,牙周组织作为承担咬合力的主要结构之一,长期处于机械环境中。机械刺激已成为影响牙周组织改建的重要影响因素。然而,机械力与炎症的双重作用对牙周组织改建及牙周病进展的机制仍不十分明确。牙周膜干细胞已被证明在维持牙周组织稳态中发挥重要作用,同时可以参与微生物引起的免疫应答反应,但其功能受到周围微环境的极大影响,包括细胞及细胞间/细胞及基质间的相互作用。骨细胞作为骨组织中最丰富的的细胞,同样对牙周组织的改建产生重要影响,但是骨细胞与牙周膜细胞间信息交流的相关研究仍然较少。因此,本研究通过对小鼠骨样细胞(MLO-Y4)施加特定频率大小的单轴循环拉伸应变,并纯化其产生的外泌体。将外泌体作用于体外培养的人牙周膜干细胞(Human periodontal ligment stem cells,hPDLSCs),探究单轴循环拉力刺激MLO-Y4后产生的外泌体对hPDLSCs增殖及成骨分化的作用。同时利用牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharides,P.g LPS)建立炎症模型,探究力学诱导产生的外泌体对炎症环境中细胞功能的调节作用。为进一步探究正常咬合力维持牙周组织正常代谢及结构的机制,及异常咬合力与牙周炎进展的关系提供新思路。方法:1.hPDLSCs的培养与鉴定。酶消化法培养人牙周膜干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术鉴定相关表面抗原CD73、CD90、CD29和CD45。2.单轴循环拉力诱导的MLO-Y4外泌体的分离和鉴定。8%,0.1Hz的单轴循环拉力作用于MLO-Y4细胞,超速离心法收集加力组与常规培养的MLO-Y4分泌的外泌体,分别标记为Exosome-MS、Exosome;透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)、蛋白印迹(Western blot,WB)、纳米粒子追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)鉴定外泌体。3.外泌体对hPDLSCs增殖及成骨分化的影响。利用P.g LPS建议炎症微环境。外泌体与P.g LPS分别或共刺激hPDLSCs,并分为P.g LPS组(LPS组)、加力外泌体组(Exosome-MS组)、P.g LPS+加力外泌体组(LPS+Exosome-MS组)、P.g LPS+正常外泌体组(LPS+Exosome组)以及对照组(Control组)。利用CCK8、Ed U染色观察细胞增殖活性;碱性磷酸酶染色、茜素红染色检测细胞成骨能力。4.外泌体介导的机械力促进PDLSCs增殖成骨分化的潜在机制。对MLOY4受力及常规培养时产生外泌体中的micro RNA进行高通量测序,通过Target Scan等数据库预测靶基因参与的信号通路。荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、荧光素酶报告分析、real-time PCR和Western blot进一步证实了外泌体通过miR-181b-5p调节hPDLSCs增殖及成骨分化的机制。结果:1.成功分离hPDLSCs。显微镜下可以见细胞呈长梭形或星形,流式细胞术结果显示细胞表面抗原CD45阴性,CD73、CD146、CD90阳性,表明所培养细胞为间充质来源的干细胞。2.受到循环拉伸应力后的MLO-Y4分泌外泌体增多,超速离心法成功收集外泌体。WB显示外泌体标志蛋白CD63、CD81及Alix阳性,TEM及NTA结果显示,超速离心分离得到的沉淀颗粒直径在30-140nm之间。3.CCK8与Ed U结果显示,P.g LPS抑制细胞增殖和分裂活性,机械刺激MLO-Y4产生的外泌体促进hPDLSCs增殖,并能够部分改善LPS抑制作用,而对照组外泌体无明显改善作用。ALP及茜素红染色结果表明,各组hPDLSCs的成骨分化能力表现出与细胞增殖能力变化相同的趋势。4.miRNA测序结果显示,外泌体miRNA的功能主要集中在细胞代谢、微环境中细胞间信息交流以及对微生物感染的免疫应答。RT-PCR证明ExosomeMS中miR-181b-5p表达上调,与对照组相比有统计学差异(P<0.01)。FISH结果显示miR-181b-5p主要分布于细胞质中;荧光素酶报告实验表明miR-181b-5p和磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)之间存在结合位点,miR-181b-5p是PTEN的负调控因子。过表达或抑制miR-181b-5p可影响细胞内PTEN/PI3K/AKT调节细胞增殖,还可影响BMP2/Runx2表达水平,进而调节成骨分化。结论:1.适当的机械力在维持牙周组织正常结构,及牙周炎治疗后的组织修复过程中发挥重要作用。2.单轴循环拉伸应力诱导骨细胞分泌的外泌体中miR-181b-5p上调,结合并沉默PTEN,激活hPDLSCs中AKT信号通路。miR-181b-5p/PTEN/AKT通路是机械力促进hPDLSCs增殖的潜在机制之一。3.同时miR-181b-5p还可以通过影响BMP2/Runx2参与的信号通路调节hPDLSCs成骨分化。