【摘 要】
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目的胃癌（Gastric Cancer,GC）是一类发病率和死亡率极高的恶性肿瘤,由于胃癌早期缺乏明显的症状和体征,多数患者就诊时病情已进展至晚期。因此,明确胃癌发病机制和相关治疗靶点是非常重要的。近年来,随着分子生物学的发展,国内外大量学者开始从遗传学和表观遗传学两个层面深入探究胃癌发病机制,其中表观遗传学中DNA甲基化已成为目前研究的主流方向,基因启动子区发生甲基化的改变将会导致胃癌的发生和发
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目的胃癌（Gastric Cancer,GC）是一类发病率和死亡率极高的恶性肿瘤,由于胃癌早期缺乏明显的症状和体征,多数患者就诊时病情已进展至晚期。因此,明确胃癌发病机制和相关治疗靶点是非常重要的。近年来,随着分子生物学的发展,国内外大量学者开始从遗传学和表观遗传学两个层面深入探究胃癌发病机制,其中表观遗传学中DNA甲基化已成为目前研究的主流方向,基因启动子区发生甲基化的改变将会导致胃癌的发生和发展。早期的一些研究表明,黏蛋白基因可能位于基因组中甲基化的热点。本研究旨在探讨甲基化调控对黏蛋白MUC6表达的影响以及MUC6对胃癌转移的影响。方法1.采用IHC和q PCR检测人胃癌组织及癌旁组织MUC6的表达水平。2.采用WB检测胃细胞系中MUC6蛋白相对表达量,筛选出MUC6表达水平最高和最低的细胞株分别转染si MUC6和MUC6过表达质粒,Transwell实验检测MUC6低表达和过表达对胃癌细胞迁移、侵袭的影响。3.通过q PCR检测胃癌组织和癌旁组织MUC6启动子区域甲基化水平。4.用M.Sss I甲基转移酶对MUC6过表达质粒Cp G未甲基化胞嘧啶残基进行甲基化修饰,Bst UI限制性内切酶验证甲基化的保护程度,并用双荧光素酶检测MUC6启动子区甲基化后是否影响其与转录因子的结合。5.WB和q PCR检测不同浓度的去甲基化药物5-氮杂胞苷随着时间的增加作用于胃癌细胞SGC7901时MUC6的表达水平。结果1.IHC（P<0.05）和q PCR（P<0.01）均显示胃癌组织中MUC6表达水平低于癌旁组织。2.正常人胃黏膜细胞株GSE-1和人胃癌细胞株MGC03、MKN45、AGS、SGC7901以及BGC823中均有MUC6表达,但在GSE-1细胞表达最高,GC7901细胞表达最低。选取SGC7901细胞转染MUC6过表达质粒,经q PCR（P<0.001）和WB（P<0.001）检测发现MUC6表达水平明显高于对照组,SGC7901细胞的迁移（P<0.001）和侵袭（P<0.05）能力明显下降;选取GES-1细胞转染si MUC6质粒,经q PCR（P<0.01）和WB（P<0.001）检测发现MUC6表达水平显著低于对照组,GES-1细胞的迁移和侵袭能力明显提高（P<0.001）。3.通过q PCR检测显示,胃癌组织中MUC6甲基化水平高于癌旁组织。4.M.Sss I甲基转移酶修饰及Bst UI限制性内切酶验证结果显示,M.Sss I甲基转移酶对质粒DNA的甲基化修饰保护有良好效果;双荧光素酶检测结果显示MUC6启动子区经过甲基化后荧光降低,证明确实干扰了启动子区与转录因子的结合。5.WB和q PCR检测显示,MUC6的表达随去甲基药物浓度和作用时间的增加而增加。结论胃癌组织中MUC6的表达水平显著低于癌旁组织;转染MUC6过表达质粒抑制胃癌的侵袭、转移能力,转染si MUC6质粒促进胃癌的侵袭、转移能力;胃癌组织中MUC6甲基化水平高于癌旁组织,MUC6启动子区甲基化影响与其转录因子的结合且MUC6的表达明显受甲基化的调控;启动子甲基化调控MUC6的表达从而促进胃癌的转移。
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