论文部分内容阅读
目的研究KHSRP在坐骨神经损伤后的表达情况,探究KHSRP与施万细胞分化和神经元轴突再生的关系,分析KHSRP与β-catenin的相互调节关系及两者在施万细胞分化和神经元轴突再生过程中的作用,进一步揭示KHSRP在周围神经损伤后的再生机制。方法1.为了研究KHSRP在损伤后坐骨神经中的表达,本研究通过构建大鼠坐骨神经夹伤模型,利用western blot,免疫组织化学技术检测了KHSRP在正常组织及损伤组织中的表达；采用免疫荧光方法检测了KHSRP的细胞定位情况,分析其与施万细胞分化和神经元轴突再生的关系2.为了研究KHSRP在施万细胞分化过程中的作用,本研究通过构建原代施万细胞体外分化模型,western blot及RT-PCR技术检测KHSRP、β-catenin及相关蛋白在此过程中的表达情况；通过核浆分离检测KHSRP的胞浆转移情况；通过构建KHSRP小干扰RNA及β-catenin过表达质粒并结合免疫细胞荧光技术检测KHSRP是否通过调节β-cateni n的稳定性从而介导施万细胞的分化。3.为了研究KHSRP在神经元突起生长过程中的作用,采用100ng/ml NGF刺激未分化的PC12细胞,模拟神经元体外分化过程,以及构建原代DRG神经元体外发育模型,检测KHSRP在神经元延伸过程中的表达、胞浆转运及对神经元突起延伸的影响。4.原代施万细胞和神经元的共培养,模拟坐骨神经损伤后施万细胞的再成髓鞘化过程,检测KHSRP、β-catenin的表达及KHSRP的胞浆运输对β-catenin稳定性的影响。结果1. western blot免疫组化分析显示,KHSRP在坐骨神经损伤后表达升高,在第5天达到最高,随后逐渐回复。免疫荧光结果显示KHSRP NF200、S100及Oct-6阳性的细胞中均有表达,提示KHSRP可能在施万细胞分化和神经元轴突再生过程中发挥作用。2.在cAMP诱导的施万细胞分化过程中, KHSRP的表达升高,而β-catenin的表达降低。核浆分离结果显示KHSRP在分化过程中胞浆蛋白水平增加,相应此时β-catenin的胞浆蛋白水平降低,提示KHSRP可能通过调节β-catenin的稳定性来介导施万细胞的分化。KHSRP的小干扰RNA转染施万细胞后抑制了施万细胞分化的形态发生,该效应与过表达β-catenin的施万细胞形态相似。3.NGF刺激PC12细胞分化和体外培养的原代DRG神经元发育的过程中,KHSRP的蛋白及mRNA水平的表达均升高,而β-catenin成相反趋势。此外也相应观察到KHSRP的胞浆聚集及β-catenin的胞浆稳定性降低现象。KHSRP的小干扰RNA转染的PC12或DRG神经元突起延伸也受到影响。4.施万细胞和DRG神经元共培养过程中,KHSRP在1d表达最低,随后随着施万细胞髓鞘化,表达逐渐增高,β-catenin的表达呈相反趋势。核浆分离也显示出KHSRP的胞浆转移及β-catenin的稳定性衰退现象。结论1.KHSRP在坐骨神经损伤后参与施万细胞分化和神经元轴突再生过程。2.KHSRP通过调节自身的核浆分布来影响β-catenin的稳定性,从而介导周围神经的再生过程。