论文部分内容阅读
第一部分RNA干扰OPN基因的慢病毒载体的构建及鉴定目的:构建并制备携带靶向shRNA-OPN基因的慢病毒载体。方法:根据OPN的基因序列设计四条siRNA作为RNA干扰靶点,分别构建4个shRNA质粒表达载体并通过PCR和测序进行鉴定。经鉴定正确后分别转染293T细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果。选取最有效的靶点包装OPN-RNAi慢病毒。对所获病毒载体进行鉴定分析和滴度测定。结果:构建的质粒表达载体经PCR鉴定均可扩增出预期条带,测序证明质粒构建成功。Western blot显示KD1,KD2,KD3,KD4靶点对目的基因的表达都有显著敲减作用,逐孔稀释滴度测定法测定shRNA-OPN病毒滴度约为2×109 TU/ml。结论:成功制备了OPN-shRNA慢病毒载体。第二部分OPN-shRNA对人膀胱癌(T24细胞)生物学行为影响的体外研究目的:观察由慢病毒携带的OPN-shRNA对体外培养的人膀胱癌的抑制作用。方法:将OPN-shRNA转染入人膀胱癌T24细胞株中,并测定转染效率。PCR、Western blot检测OPN mRNA和蛋白表达,MTT法检测干扰组(OPN-RNAi组)增殖能力,流式细胞仪检测周期, Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,Transwell小室检测其侵袭能力。结果: OPN-shRNA被成功地转染入T24细胞中,转染效率在90%以上。与阴性对照组和空白对照组比较,干扰组(实验组)OPN细胞的mRNA表达明显受到抑制,同样的结果见于蛋白表达的检测中。同时,干扰组细胞增殖能力下降,凋亡率增高、侵袭能力下降。结论:在体外,OPN-shRNA能抑制人膀胱癌T24细胞株的OPN基因表达,并能抑制细胞增殖,促进凋亡,抑制侵袭转移能力。第三部分OPN-shRNA对人膀胱癌(T24细胞)生物学行为影响的体内研究目的:在整体水平研究OPN-shRNA对T24生长、转移和浸润行为的抑制作用。方法:建立人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型。在皮下模型中,按500ug标准在瘤内分别注射OPN-shRNA,阴性对照shRNA病毒,等量生理盐水观察抑瘤效果, S-P法检测OPN、VEGF蛋白表达。结果:干扰组皮下移植瘤生长明显受抑制,体积和重量明显小于阴性对照组和空白对照组。OPN、VEGF蛋白表达弱于对照组(OPN, H= 11.2049,P=0.0037; VEGF, H=9.5697, P=0.0084)。结论在体内实验中,OPN-shRNA能明显抑制人膀胱癌的生长,减少新生血管形成,显示一定的抑瘤效应。