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膀胱移行细胞癌(Bladder transitional cell carcinoma，BTCC)是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，严重危害人民的身体健康。近年来，手术方法不断改进，灌注药物日益更新，但膀胱肿瘤术后5年复发率仍高达50～70％。提高化疗药物的敏感性是延长BTCC病人无瘤生存时间和改善生存质量的途径。我们的前期体外实验证实纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)介导了BTCC的多药抵抗(Multidrug resistance，MDR)，是导致膀胱癌化疗效果下降的原因之一。本研究分二部分：第一部分，探讨外源性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(Arg-Gly-Asp peptide，RGD肽)是否可在体外减少甚至逆转FN介导的人膀胱癌5637细胞化疗抵抗；第二部分，探讨人BTCC肿瘤细胞化疗抵抗过程中，FN和RGD肽对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。本研究旨在为FN拮抗剂RGD肽应用于BTCC的治疗提供理论及实验依据，并了解其分子机制。第一部分RGD肽抗纤维连接蛋白介导人膀胱癌5637细胞化疗抵抗作用的实验研究目的：探讨FN是否能诱导人BTCC5637细胞产生药物抵抗；RGD肽是否可在体外减少甚至逆转FN介导的膀胱癌化疗抵抗。方法：根据施加影响因素不同，实验组细胞分为牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)组、FN组、RGD肽组、FN+RGD组，其中1％的BSA、100μg／ml的FN预先包被细胞培养板，孵育24h，加入不同浓度的丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC)，用MTT比色法检测作用后不同时间(2h、12h、24h)肿瘤细胞的生存率，用荧光染色观察5637细胞具有的凋亡形态学改变。采用流式细胞仪(PI和annexin V双染法)检测细胞凋亡率的变化。结果：1．不同MMC作用2h、12h、24h后的5637细胞各组平均生存率：BSA组分别为78.88％、59.16％和42.36％；FN组分别为86.57％、68.53％和48.46％；RGD组分别为72.51％、51.04％和37.23％；FN+RGD组分别为77.40％、57.58％和43.65％。FN组的细胞生存率最高(P＜0.05)，RGD组的细胞生存率最低(P＜0.05)。2．MMC(50mg／L)作用2h后各组细胞在荧光显微镜下观察调亡细胞比例，排列顺序从高到低为RGD组、FN+RGD组、BSA组、FN组，MMC作用后12h，这种差别依然存在。3．Annexin V／PI双染法结果显示，在MMC(50mg／L)作用2h后，FN组早期凋亡细胞(LR)所占比例平均为0.7％，晚期凋亡细胞(UR)所占比例平均为1.14％，与RGD组(LR=2.29％，UR=2.49％)、BSA组(LR=1.47％，UR=2.04％)、FN+RGD组(LR=1.66％，UR=1.87％)相比明显降低，差异有显著性(P＜0.05)，RGD组的UR和LR较其他各组明显增高(P＜0.05)；总的凋亡细胞百分比比例自高到低排列为RGD组(4.767％)、FN+RGD组(3.533％)、BSA组(3.513％)、FN组(1.847％)。4．Annexin V／PI双染法结果显示，在MMC(50mg／L)作用后12h，FN组早期凋亡细胞(LR)所占比例平均为10.30％，晚期凋亡细胞(UR)所占比例平均为0.63％，与RGD组(LR=26.33％，UR=1.32％)、BSA组(LR=15.47％，UR=0.83％)、FN+RGD组(LR=14.20％，UR=1.10％)相比明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，RGD组的UR和LR较其他各组明显增高(P＜0.05)；总的凋亡细胞百分比比例自高到低排列为RGD组(27.65％)、FN+RGD组(15.30％)、BSA组(16.29％)、FN组(10.94％)。结论：1．FN能诱导人膀胱癌5637细胞对抗MMC产生的促细胞凋亡作用；2．RGD肽可减少或抑制FN介导的MDR。第二部分RGD肽抗纤维连接蛋白介导人膀胱癌细胞化疗抵抗作用机制的实验研究目的：探讨人BTCC肿瘤细胞化疗抵抗过程中，FN和RGD肽对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法：根据施加影响因素不同，实验组细胞分为BSA组、FN组、RGD肽组、FN+RGD组，其中1％的BSA、100μg／ml的FN预先包被细胞培养板，孵育24h，加入MMC(50mg／L)作用2h，继续培养24h后用western blotting技术，分别观察T-24细胞和5637细胞中各组二磷酸腺苷核糖多聚酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]、P53、Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果：1．在MMC作用下，FN与T-24细胞和5637细胞的表面受体结合后，裂解的PARP片段(89KD)的表达减少；RGD肽能逆转FN引起的，表现为PARP片段的表达增加。2．FN组中P53表达下降；施加RGD肽后，P53表达增多。3．FN与T-24细胞和5637细胞的表面受体结合后，Bax表达下降，Bcl-2的表达增高；施加RGD肽后，Bax表达增高，Bcl-2的表达下降。4．FN与T-24细胞和5637细胞的表面受体结合后，Bax／Bcl-2的比例减少；施加RGD肽后，Bax／Bcl-2的比例增高。结论：1．FN能通过调高与细胞外基质相关的细胞凋亡信号系统中Bcl-2的表达，抑制PARP裂解片段、P53、Bax的表达来介导膀胱癌的多药抵抗。2．RGD肽能抑制Bcl-2的表达，调高PARP裂解片段、P53、Bax的表达，来逆转FN引起的蛋白表达变化。