柠檬烯是一种重要的单环单萜,其在医药、食品、日化、香料、清洗剂等行业有广泛的用途。在现行的生产方法中,柠檬烯是从柑橘类的果实中提取得到,但是这种制备方法受原料的影响很大。随着柠檬烯的应用范围不断扩大,其需求必然也不断的增加。采用合成生物学的方法生物合成柠檬烯,能够为柠檬烯的生产开辟新的方法。本文利用合成生物学的方法,在大肠杆菌中引入了柠檬烯合成途径,构建了能够高效地合成柠檬烯的大肠杆菌菌株。采用模块化的策略,将整个柠檬烯合成途径分为上游、中游和下游三个模块,其中上游模块包括来源于粪肠球菌的mva E和mva S,中游模块包括来源于酿酒酵母的MK、PMK、PMD和IDI基因,下游模块包括来源于冷杉的GPPS和来源于柠檬烯薄荷的LS基因。将三个模块导入到大肠杆菌BW25113(DE3)中得到ELIM17菌株,柠檬烯的产量为11.71 mg/L。在中游模块的优化过程中,对mva S基因进行了定点突变,将甲羟戊酸的产量提高了2.7倍,产量达到了485.99 mg/L,为mva E和mva S基因筛选了合适的RBS序列,使甲羟戊酸的产量进一步提高到了1304.36 mg/L,柠檬烯的产量提高到了84.97mg/L,但是发现甲羟戊酸有大量的积累(622.86 mg/L)。对中游模块进行优化时,用催化活性更高的来源于甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)的MK基因替换了来源于酵母的MK基因,而且用组成型启动子FAB80替换了T7启动子,这使得甲羟戊酸的积累量降低到了33.78 mg/L,柠檬烯的产量也提高到了183.53 mg/L。对下游模块进行优化时,将柠檬烯合成酶的底物换成NPP,将柠檬烯的产量进一步地提高到了694.61 mg/L。对发酵条件进行优化进一步提高了柠檬烯的产量,并在此基础上进行分批补料发酵实验,在84 h内柠檬烯的产量为1.29 g/L。这是第一次利用NPP为底物在大肠杆菌中合成柠檬烯,同时对其他萜类产物的合成有借鉴价值。