背景与目的 类纤维蛋白原蛋白(Fibrinogen Like Protein FGL2)是一种独特的凝血酶原激酶，与经典内源性及外源性凝血机制相区别，它可以在缺乏凝血因子Xa的情况下，直接将凝血酶原水解为凝血酶，从而启动凝血系列反应。前期的实验证明其在暴发性肝炎及先天性流产发病机制中有重要意义。有学者指出其对异种移植急性血管性排斥反应可能会有潜在作用。目前在猪到灵长类动物肾脏非协调性异种移植的实验中，采用抗体去除、补体去除，防止补体激活等方法已经克服了超急性排斥反应。尽管如此，移植肾脏仍不可避免地发生急性血管性排斥反应或者称为延迟性排斥反应，不能达到长期存活。病理表现主要是弥漫性组织间出血，微血管内血栓形成及微血管病变。我们设想FGL2是造成这一结果的重要因素，通过抑制FGL2在移植物内的表达，或者采用中和性抗体拮抗其作用可能会改善移植结果。为研究该基因的功能，我们首先需要检测该基因全长序列。为了进一步了解该基因的功能，我们需要对其基因组成进行进一步的实验分析，探索其5及3端非编码区，内含子及外显子的结构组成，并预测其蛋白质表达序列及结构。作为一种独特的凝血酶原激活物，该基因在异种移植中的作用到底如何，只有通过异种移植实验本身才能得到验证。我们推测在异种移植反应过程中，移植物内皮细胞活化后表达FGL2增加，从而启动凝血反应有可能是导致急性血管性排斥反应AVR的一个重要机制，本实验通过分离培养离体野生型及hDAF转基因猪主动脉内皮细胞在异种血清培养，及活体猪至狒狒肾脏异种移植模型，分析FGL2在这些细胞及组织中表达情况，以探讨该分子在异种移植AVR中的作用。 材料与方法 1．猪基因组DNA文库筛查：FGL2基因在人和小鼠同源序列部分设计探针，采用α[~32P]dCTP随机引物法标记其作为同位素探针，分别得到探针1及探针2，筛查猪基因组DNA文库。得到阳性克隆后转化大肠杆菌K802扩增，提取纯化DNA对它们进行限制性酶切，琼脂糖凝胶电泳分析得到限制酶切图谱，仍采用上述特异性DNA探针，Southern杂交分析目的基因所在位置，限制性酶切获得目的片段基因，亚克隆与质粒DNA连接，转化大肠杆菌扩增后测序，得到部分基因序列。2．染色体游走：根据获得猪FGM基因 3部分序列设计探针 3：上游引物 3：5＼ ATA，TAA，GCG，AGT，GTC，CCC，TGA，n－3飞下游引物 3：5”－’I’IT，TCC，TCA，GTG，ATG，AGT，GAA，CC－3长度527碱基对。探针 4：上游引物 4：5”－CAA，AAA，TGC，AGC，TI’f，CCC，CAT，T－3 ’：下游引物 4：5”－GGA，GTG，CAC，’I’IT，TGA，TCA，CAG，AAA－3长度471碱基对。自培养猪动脉内皮细胞提取新鲜基因组 DNA，以该 DNA为模板行 PCR反应，采用 a［罚P」CW随机5！物法标记其作为同位素探针，分别得到探针3及探针4，重新筛查猪基因组DNA文库。得到阳性克隆后扩增测序。3．猪FGM－3末端基因组DNA－PCR反应：依据猪与人FGIZ基因3端已知同源序列设计PCR上游引物5二AAT，AGG，ATA，CCA，AAT，GTA，AAT，G－31根据人 FGIn基因 3末端序歹设计下游引物 5”－TGG，TGT，TCC，TCT，An，TGC，CTC，T－3飞以猪基因组DNA为模板应用 Advantage 2 Polymerase mix（CLONTECH）进行PCR反应，对PCR产物纯化后通过TA克隆扩增，提取重组质粒DNA并测序。4．猪与人及小鼠FGLZ基因序列对比分析：BLAST软件5．猪FGth基因染色体荧光免疫原位杂交分析：以阳性克隆纯化DNA标记为荧光探针检测该基因在猪染色体组内的位点。6．FGIn基因预测：采用BLAST软件，对已知猪基因组DNA序列与人及小鼠FGIn基因对比分析，根据结果推测猪FGM基因的外显子位置结构，及转录起始位置．以GENESCAN软件推测该基因组成结构，启动子 TATABOX．7．逆转录巩R反应 RT－PCR：从正常猪新鲜心脏小肠组织中提取总RNA标本，根据计算机软件预测基因结构分析设计上游引物：GCC，ACCG，CAG，AGA，TGA，AG；下游引物：CAG，ACC，CAA，GTA，C rIT，TAA，GCC，ATA八；采用 QIAGEN one step RTPR kit行逆转录PCR反应．以无RNA标本及元逆转录反应作为阴性对照，以GADjPH引物为阳性对照．8．Nowhem杂交：从正常猪新鲜心脏，肝脏，肺脏，肾脏，小肠，胰腺，脾脏组织中提取总RNA标本，加人RNA琼脂糖凝胶电泳，长波紫外灯拍照后，将凝胶中RNA毛细管转移法转移至硝酸纤维素滤膜。以同位素”P采用随机引物法标记编码区 1341碱基 DNA探针，杂交后采用放射自显影暴光72小时。以20XSSC及氢氧化钠溶液煮沸法剥除该探针 ·2·后，分别以同位素’中采用随机引物法标记 185 r RNA 64碱基对 cDNA探针；GAPDH 748碱基对 DNA探针，进行杂交，作为阳性对照，及 RNA质量检测。9．猪FGLZ基因CDNA末端快速扩增：从正常猪新鲜小肠及心脏组织中提取总RNA标本，采用POwerSCriPt”逆转录酶行RTPCR合成CDNA反义链，以其作为模板。根据已知基因序列，设计FGIZ基因特异性引物及内套基因特异性引物：应用复合多聚胸腺嘴陡引物以