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第一部分透明质酸酶及阿霉素细胞毒性实验(CCK8实验)目的:通过细胞实验研究透明质酸酶及阿霉素对Hep G2肝癌细胞的毒性,优选药物浓度和作用时间。材料与方法:将对数生长期的Hep G2细胞分别以空白培养基和含不同浓度透明质酸酶或阿霉素的培养基进行不同时间的培养。细胞预定培养时间结束后使用酶标仪测定450 nm光吸收值,以溶剂处理的细胞为对照组,不含细胞的培养基为空白组,按公式计算药物对细胞的抑制率。结果:透明质酸酶不同药物浓度及作用时间对Hep G2细胞的抑制率无明显差异,0、30、60、120min的IC50分别为536.743μM、483.112μM、425.019μM和416.206μM。阿霉素不同药物浓度及作用时间对Hep G2肝癌细胞的的抑制率结果显示0、30、60、90、120 min的IC50分别为4622.767μM、1273.328μM、678.042μM、329.50μM和183.767μM。结论:不同透明质酸酶药物浓度及作用时间情况下,对Hep G2肿瘤细胞基本无毒性作用;结合实验结果,后继细胞实验采用透明质酸酶药物浓度为160μM,作用时间为60min。同时由于后续实验涉及多细胞球形体内阿霉素药物荧光的数量和渗透距离,要求细胞存活率在80%以上,综合阿霉素药物浓度和作用时间的优化组合因素,选择阿霉素药物浓度为160μM、作用时间为60min。第二部分透明质酸酶对肿瘤多细胞球形体内阿霉素分布的影响目的:通过细胞实验研究透明质酸酶对多细胞球形体内阿霉素药物分布的影响。材料与方法:采用转瓶琼脂法体外培养人Hep G2肝癌细胞多细胞球形体,分为两组,分别接受阿霉素、阿霉素+透明质酸酶处理,透明质酸酶药物浓度均为160μM,干预时间60min,处理后采用荧光显微镜观察肿瘤多细胞球形体内的阿霉素药物荧光的分布,并采用Image Pro Plus软件计算多细胞球形体内阿霉素药物荧光的数量和渗透距离。结果:Hep G2多细胞球形体直径两组间无明显差异;阿霉素+透明质酸酶组在阿霉素药物荧光面积、荧光强度和荧光渗透距离方面明显高于单纯阿霉素组。结论:透明质酸酶可明显促进阿霉素在肿瘤多细胞球体内的渗透。第三部分透明质酸酶对肿瘤间质液压的影响目的:通过不同给药途径比较透明质酸酶对肿瘤间质液压的影响,优选透明质酸酶给药方案及作用时间。材料与方法:购置新西兰大白兔15只,雌雄不限,体重2.5~3.0kg。通过移植方式建立15只实验兔VX2肝癌模型,肿瘤种植外置位于肝左外叶。术后17天采用MRI检测肿瘤大小。将15只荷瘤兔分为3组(每组5只),A组(空白对照组)未做任何处理;B组(耳缘静脉组,IV组)通过兔耳缘静脉注射透明质酸酶溶液10ml(10mg/ml);C组(肝动脉灌注组,TAI组)通过肝动脉灌注透明质酸酶溶液10ml(10mg/ml);先将压力导管埋入实验兔VX2瘤体内,实时观察压力读数变化,待压力读书稳定后开始灌注透明质酸酶并通过计算机记录间质液压,实验结束后根据相关数值绘制时间-间质液压曲线。结果:肿瘤内间质液压TAI组变化率最大,IV组次之,对照组最小,给药40min后肿瘤间质液压降至“平台期”。结论:透明质酸酶经可有效降低肿瘤内间质液压,其中通过介入的方式经肝动脉给药更具优势,给药40min后肿瘤间质液压改变趋于稳定。第四部分经导管介入治疗联合透明质酸酶治疗肝癌的疗效与机制目的:评价TACE联合透明质酸酶对肝癌经导管介入治疗药物渗透和疗效的影响,初探联合治疗机制。材料与方法:建立20只兔VX2肝癌模型,分成两组每组10只,分别接受阿霉素经肝动脉注入+PVA栓塞(c TACE组)和透明质酸酶经肝动脉注入+阿霉素经肝动脉注入+PVA栓塞(TACE联合透明质酸酶组);每组5只动物于处理后0~1小时采用微尖导管压力传感器活体检测肿瘤间质液压,并于术后4小时处死采用免疫荧光技术检测药物渗透;每组另5只动物于处理后7天处死采用HE染色评价肿瘤坏死率,比较肿瘤间质液压、组织内药物渗透及浓度和坏死率的组间差异,分析它们之间的关系。结果:肿瘤内间质液压改变两组间存在显著性差异,TACE联合透明质酸酶组(58.7%±9.8%)明显大于c TACE组(35.8%±8.3%)(P=0.004);TACE联合透明质酸酶组及c TACE组阿霉素荧光点数分别为3330.91±945.73及1564.38±633.99(P<0.01);两者阿霉素相对渗透距离分别为38.06±8.72μM及29.51±4.76μM(P<0.05),TACE联合透明质酸酶组明荧光点数及阿霉素渗透距离均明显高于单纯阿霉素组。TACE联合透明质酸酶组及c TACE的阿霉素浓度组内比较显示其术后7天肿瘤内阿霉素浓度都比术后4小时肿瘤内阿霉素浓度降低;对于同一时间点而言,TACE联合透明质酸酶组肿瘤内阿霉素浓度均明显高于c TACE组,两者比较均有统计学差异(P=0.021,P=0.0004);TACE联合透明质酸酶组的肿瘤坏死率(90.61%±5.38%)也明显高于c TACE组(77.49%±7.11%)(P=0.011)。结论:透明质酸酶可通过降低肿瘤内间质液压而促进阿霉素对肿瘤实质的渗透,改善药物分布,增加肿瘤实质内药物浓度,从而提高TACE的治疗效果。