论文部分内容阅读
目的:通过探究补阳还五汤对于高脂喂养的ApoE-/-小鼠的胆固醇逆转运相关蛋白的影响,从而探讨补阳还五汤预防与治疗动脉粥样硬化的机制。方法:(1)以中医药大数据的信息技术为手段,基于中药系统药理学平台,人类表型本体数据库,对补阳还五汤防治动脉粥样硬化进行关联分析。构建“补阳还五汤-中药-化学成分-核心靶点-关键通路”的可视化网络,并对核心靶点进行聚类分析。(2)将雄性ApoE-/-小鼠随机分为空白对照组,模型对照组,补阳还五汤组,阿托伐他汀组,每组10只小鼠。空白组给予普通饲料,其余小鼠高脂饲料喂养,共9周。9周后采用全自动生化分析仪检测TC,TG,LDL-C,HDL-C。采用油红O染色方法观察,并测量红色脂滴所占管腔面积之比。蛋白质印迹法测定主动脉和肝脏LXRα,LXRβ和肝脏PPARy,ABCA1,磷酸化p38,ERK1/2及ApoA-I的蛋白表达;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)测定肝脏 LXRα,LXRβ 的 mRNA 表达。阻断反应实验采用高脂喂养的C57BL/6J小鼠,随机分为6组:模型组,补阳还五汤组,LXR阻断+补阳还五汤组,p38阻断+补阳还五汤组,LXR阻断组,p38阻断组,每组8只小鼠。喂食小鼠高脂饲料连续25天,1周后补阳还五汤组、LXR阻断+补阳还五汤组以及p38阻断+补阳还五汤组给予补阳还五汤灌胃,在最后3天LXR阻断组,LXR阻断+补阳还五汤组腹腔注射LXR阻断剂SR9238,p38阻断组,p38阻断+补阳还五汤组腹腔注射p38阻断剂SB203580。蛋白质印迹法测定LXRα,LXRβ,ABCA1,p38及ApoA-I的蛋白表达。结果:(1)通过网络药理学的方法,筛选出补阳还五汤的174个核心靶点与动脉粥样硬化密切相关。补阳还五汤可能参与调节癌症,乙型肝炎,PI3K-Akt通路以及T细胞受体信号传导通路等在内的炎症和免疫相关通路。对核心靶点网络互作进行聚类分析发现核心靶点参与了胆固醇外排,胆固醇稳态,胆固醇逆转运等生物过程。其中核心靶点p38,ApoA-I被后续的实验证实参与补阳还五汤对动脉粥样硬化的治疗,而补阳还五汤对ERK1/2的影响并不显著。(2)病理学观察,与空白组相比,模型组主动脉三尖瓣区脂滴占比增加(p<0.001);与模型组相比,阿托伐他汀组与补阳还五汤组均能显著降低主动脉的脂滴所占比例(p<0.01)。与空白组相比,高脂喂养的ApoE-/-小鼠血清TC,TG,LDL-C和HDL-C水平显著增加(p<0.001);与模型组相比阿托伐他汀组与补阳还五汤组均能降低ApoE-/-小鼠TC,TG,LDL-C和HDL-C的水平(p<0.001);mRNA与蛋白水平,与空白组相比,模型组主动脉中LXRα,肝脏LXRα,LXRβ,ABCA1,磷酸化p38及ApoA-I蛋白的表达明显降低(p<0.05,p<0.01,p<0.001),但 PPARγ,磷酸化 ERK1/2 的蛋白表达以及 LXRα,LXRβ的mRNA变化不具有统计学意义(p>0.05);与模型组相比,阿托伐他汀组及补阳还五汤组均能有效上调肝脏中LXRα,ABCA1的蛋白表达(p<0.05,p<0.01),此外补阳还五汤组还能增加主动脉中LXRα,LXRβ以及肝脏中LXRβ,磷酸化p38和ApoA-I的蛋白表达水平(p<0.05,p<0.01,p<0.001)。同时在C57BL/6J小鼠肝脏中,磷酸化p38以及LXRβ的阻断消除了补阳还五汤诱导的ApoA-I的上调(p<0.01),但并不影响ABCA1的表达(p>0.05)。结论:本研究发现补阳还五汤改善了ApoE-/-小鼠血脂水平和主动脉脂质积累,相对于阿托伐他汀,补阳还五汤参与调控更多调节胆固醇逆转运的蛋白,具有多靶点防治动脉粥样硬化的特点。本次研究首次对p38和LXR进行了阻断,进一步证明了补阳还五汤通过LXRα/ABCA1通路和激活p38,LXRβ增加ApoA-I的表达促进肝脏的胆固醇逆转运从而调控AS的发生和发展。