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第一部分维生素D缺乏小鼠卵巢组织的微小RNA测序分析目的维生素D不仅与骨骼的生长发育有关,而且与许多其他病理状况密切相关,本研究拟寻找维生素D缺乏引起生殖系统紊乱的主要生物学过程以及信号通路,以探索维生素D在调节女性生殖系统中的相关作用机制。方法1.建立维生素D缺乏小鼠模型;2.ELISA 检测小鼠血清中 25 羟基维生素 D3（25 hydroxyvitamin D3,25,（OH）D3）、雌二醇（estradiol,E2）、黄体生成素（luteinizing hormone,LH）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）及睾酮（testosterone,T）的水平;3.HE染色观察两组小鼠卵巢形态和各级卵泡计数;4.提取小鼠卵巢组织总RNA,对维生素D缺乏小鼠卵巢组织中miRNA的表达谱进行系统性分析;筛选与对照组相比维生素D缺乏组差异表达的基因;5.运用生物信息学软件对差异表达的miRNAs进行GO以及KEGG分析;6.对微小RNA测序所得出的结果进行RT-qPCR进一步验证。结果1.维生素D缺乏组的小鼠血清25,（OH）D3浓度相比对照组显著下降（p＜0.001）。缺乏组E2较对照组小鼠降低（p＜0.05）、FSH、LH含量降低,但无显著差异,T含量升高（p＜0.05）;2.与对照组相比,维生素D缺乏组小鼠原始卵泡数和窦状卵泡数目无明显差异,窦前卵泡（P＜0.05）和黄体数量减少（P＜0.01）,闭锁卵泡数目增多（P＜0.01）;3.对卵巢样本差异表达miRNAs进行聚类分析,其中显著上调的有17个,显著下调的有16个;4.差异表达基因分析发现维生素D缺乏小鼠卵巢显著变化miRNAs与PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、HTLV-I感染、RAS信号通路等生殖系统调控信号通路密切相关;5.RT-qPCR进一步证实了维生素D缺乏后与生殖系统调控密切相关miRNAs,如miR-3970、miR-378d及miR-1306-3p的表达差异与测序结果一致。结论本研究通过建立维生素D缺乏小鼠模型,基于miRNA测序数据的生物信息学分析从miRNA水平上探究了维生素D缺乏组与对照组的组间差异表达基因在卵巢组织中的作用。研究表明,维生素D缺乏可能通过导致卵巢相关的各种激素的生物学过程改变,影响PI3K-Akt信号通路、胰岛素信号通路、GnRH信号通路等相关通路的活性,从而导致了卵巢功能障碍的发生,为临床上阐明女性维生素D缺乏引起生殖系统疾病的发病机制以及女性生殖障碍的防治提供新的靶点。第二部分miR-378d在维生素D缺乏小鼠卵巢组织中的表达及意义目的检测维生素D缺乏对小鼠卵巢组织及性激素调节的重要调控基因,检测miR-378d在维生素D缺乏小鼠卵巢组织中的表达,并探讨其对卵巢功能影响的作用机制。方法1.建立维生素D缺乏小鼠模型;2.ELISA检测小鼠血清中25,（OH）D3水平;3.RT-qPCR进一步验证miR-378d在维生素D缺乏小鼠卵巢组织中的表达;4.借助生物信息学软件进行预测,发现Rsbn1可能是miR-378d的靶基因,RT-qPCR检测Rsbn1 mRNA在维生素D缺乏小鼠卵巢组织中的表达;5.Western blot检测维生素D缺乏小鼠卵巢组织中Rsbn1蛋白的表达情况。结果1.维生素D缺乏组的小鼠血清25羟基维生素D浓度（7.10±2.90）ng/mL与对照组（43.41±5.35）ng/mL 相比显著下降（p＜0.001）;2.RT-qPCR检测miR-378d在维生素D缺乏组小鼠卵巢组织中异常高表达,与第一部分miRNA测序结论一致;3.我们借助生物信息学软件进行预测,发现Rsbn1可能是miR-378d的靶基因,RT-qPCR检测与对照组相比维生素D缺乏组小鼠卵巢组织中Rsbn1 mRNA水平无明显变化;4.Western blotting检测发现维生素D缺乏组较对照组小鼠卵巢组织中Rsbn1蛋白表达显著降低,差异有显著统计学意义。结论维生素D缺乏小鼠卵巢组织中miR-378d表达显著升高,与miRNA测序结果相符。miR-378d表达水平与Rsbn1蛋白表达有可能密切关联,需要后续进一步的功能学实验验证（详见第三部分实验）。第三部分维生素D缺乏的小鼠颗粒细胞中miR-378d通过靶向调节Rsbn1抑制Glut4的表达目的研究拟定通过相关实验进行进一步论证,探索miR-378d在卵巢颗粒细胞中具体相关信号通路如何发挥作用,并深入探讨miR-378d在维生素D缺乏的小鼠颗粒细胞中的可能作用机制。方法1.体外培养小鼠颗粒细胞,转染miR-378d的mimic以及inhibitor,RT-qPCR检测miR-378d、Rsbn1、Glut4和Cyp19a在卵巢颗粒细胞中的mRNA表达水平。Western blot检测Rsbnl、Glut4和Cyp19a在卵巢颗粒细胞中蛋白水平的表达。观察miR-378d在卵巢颗粒细胞中对Rsbn1的转录后调控;2.双荧光素酶报告实验和功能挽救实验证实miR-378d靶向Rsbn1 mRNA的3’UTR。结果1.RT-qPCR结果显示miR-378d mRNA在mimic组中显著性上调,在inhibitor组被显著性下调;同时Glut4mRNA在mimic组中显著性下降,在inhibitor组中显著性上升,而Rsbn1和Cyp19a mRNA表达变化无显著性差异;Western blot结果显示在miR-378d过表达后Rsbn1和Glut4蛋白表达下降,在抑制miR-378d后Rsbn1和Glut4蛋白表达上升,而Cyp19a无明显变化。2.荧光素酶报告基因结果显示:野生型Rsbn1 3’UTR在miR-378dmimic影响下表达水平下降（p＜0.001）,在miR-378d inhibitor影响下表达水平上升,而miR-378d mimic和inhibitor对于突变型Rsbn1 3’UTR表达水平无显著性影响。3.功能拯救实验表明,过表达miR-378d可下调Rsbn1和Glut4蛋白的表达水平。此外,敲降Rsbn1可下调Rsbnl和Glut4的蛋白表达水平,同时抑制miR-378d和敲降Rsbn1对Rsbn1和Glut4的蛋白表达水平无显著影响。结论在缺乏维生素D的情况下,miR-378d异常增加,Rsbn1蛋白表达下调,从而影响下游分子Glut4的表达,可能导致胰岛素抵抗。无论miR-378d的过度表达或抑制,Cyp19a均未显示出明显的变化,因此表明miR-378d可能与类固醇激素的产生无关。