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研究背景:胸腺上皮肿瘤（Thymic epithelial tumors,TET）是一种来自于胸腺上皮细胞的不太常见的肿瘤,以上皮细胞的异常性过度增殖为主要特性,在所有恶性肿瘤中的发生率为0.2%至1.5%。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）将TET分为胸腺瘤（thymomas,TM）和胸腺癌（thymic carcinomas,TC）。研究者据上皮细胞的形态特征和非肿瘤性淋巴细胞占比,进一步将胸腺瘤分为5种亚型,分别为A,AB,B1,B2,B3,其预后为自A型至B3型逐渐恶化。胸腺癌在组织学上被分为7种亚型,分别为鳞状、肉瘤样、基底细胞样、粘液表皮样、小细胞、淋巴上皮细胞和透明细胞。目前,完全手术切除是TET的主要治疗方法。然而,由于早期TET缺乏特异性症状,患者在就诊时大多处于晚期。此外,对于胸腺癌患者,手术,放疗和化疗后仍有复发和转移的可能性。因此,对TET恶性进展的机制进行分析具有重要的临床意义。虽然人类基因组中的绝大部分基因,大概占比90%具备转录功能,但是仅仅只有一小部分大概占比为1.5-2%的转录本具备翻译成蛋白质的能力。非编码RNA（non-coding RNAs,ncRNAs）占据细胞核中转录产物的大部分,据转录本长度可将ncRNA 分为长链非编码 RNA（Long non-coding RNAs,lncRNAs;＞200nt）和微小 RNAs（microRNA,miRNAs;＜200nt）。越来越多的研究报道,ncRNAs在肿瘤的发生与发展方面发挥无法替代的作用,其或许可成为肿瘤治疗的有效靶点。研究发现,miRNA与肿瘤转移有密切关系,是启动肿瘤细胞侵袭、转移级联过程的重要因素。miR-525-5p在多种肿瘤中通过靶向不同的靶基因在肿瘤生成中扮演重要角色,上调其表达能够抑制肿瘤细胞活性、转移、侵袭,并诱导细胞凋亡。LOXL1-AS1是一种lncRNA,研究显示,LOXL1-AS1在多种肿瘤中异常表达,并能够通过调控miRNA/mRNA轴进入肿瘤发生的过程中。HSPA9（Mortalin）,位于染色体5q31.2上,主要存在于线粒体中,在调节细胞生长和生存中起重要作用。研究表明,在多种肿瘤中,下调HSPA9的表达可引起生长阻滞,导致细胞凋亡和死亡,并具有抑癌作用。研究目的:探究lncRNALOXL1-AS1是否可通过调控miR-525-5p/HSPA9参与TET进展。第一部分:miR-525-5p靶向HSPA9抑制胸腺肿瘤进展方法:生物信息学技术评估miR-525-5p及HSPA9的表达水平同TET患者生存时间的关系;实时荧光定qPCR技术（real time quantitative PCR）检测70例TET组织（42例TM组织和28例TC组织）和30例正常胸腺组织中miR-525-5p的表达差异;蛋白免疫印迹技术（western blotting,WB）评估HSPA9蛋白表达;应用慢病毒感染实现miR-525-5p和HSPA9的下调,应用质粒转染实现miR-525-5p的上调;双荧光素报告基因实验评估miR-525-5p和HSPA9之间的关系;CCK-8、流式细胞术、Transwell小室和体内荷瘤实验分别用来评估miR-525-5p/HSPA9对TET细胞Ty-82、Thy0517增殖活性、凋亡、侵袭和成瘤能力的影响。所有实验均进行三次重复实验,最终结果以均数±标准差（x±SD）表示。Student’s t检验和one-way ANOVA分别用来分析2组和多组间的数据差异。Kaplan-Meier生存曲线（logrank检验）分析HSPA9、miR-525-5p与TET患者总生存时间之间的相关性。皮尔森相关检验用来对TET组织样本中miR-525-5p和HSPA9的表达水平之间的相关性进行评估。结果均运用SPSS21.0（SPSS,Chicago,IL,USA）统计学软件进行统计。当P值小于0.05时差异具有统计学意义。结果:1.通过TCGA数据库,我们发现miR-525-5p低表达水平的胸腺瘤患者的5年生存率较低;通过对临床胸腺瘤和胸腺癌样本的检测,发现TET组织中miR-525-5p明显低于正常组织,且低水平的miR-525-5p预示不良预后;2.细胞活性实验表明,通过转染mimic-miR-525-5p造成的miR-525-5p表达升高的细胞活性降低,而inhibitor-miR-525-5p介导的miR-525-5p表达下调组中的细胞生长活力较对照组升高;由细胞凋亡检测结果,我们发现mimic-miR-525-5p介导的miR-525-5p表达上调组中的细胞凋亡率增加,而inhibitor-miR-525-5p介导的miR-525-5p下调后细胞的凋亡率减少了;Transwell小室实验结果显示,上调miR-525-5p水平可抑制细胞侵袭力,下调miR-525-5p促进细胞侵袭力;3.荧光素酶报告实验和WB实验结果显示,miR-525-5p可靶向HSPA9并降低其表达;4.TCGA数据库显示,HSPA9在胸腺肿瘤中显著过表达,高水平HSPA9与预后不良密切相关;临床研究也显示,TET组织中HSPA9水平上调,高水平HSPA9 5年生存率较低;同样地,我们检测了人胚胎胸腺细胞系HBT8810和胸腺瘤细胞系Thy0517和Ty-82中miR-525-5p和HSPA9 mRNA和蛋白的水平。结果显示,与HBT8810相比,Thy0517和Ty-82细胞中HSPA9 mRNA和蛋白水平升高,而miR-525-5p水平降低;5.TET组织中miR-525-5p与HSPA9水平呈负相关;6.进一步实验表明,下调HSPA9的表达明显挽救了下调miR-525-5p介导的细胞增殖、侵袭增强和凋亡降低的趋势;7.动物实验结果表明,较inhibitor-miR-525-5p+sh-NC组相比,inhibitor-miR-525-5p+sh-HSPA9组瘤子的质量和体积明显降低。此外,较inhibitor-miR-525-5p+sh-NC 组相比,inhibitor-miR-525-5p+sh-HSPA9 组肿瘤组织中HSPA9的表达水平明显降低。结论:miR-525-5p在TET中表达降低,HSPA9表达升高,均与TET患者不良预后相关;下调miR-525-5p通过靶向HSPA9促进TET细胞增殖、侵袭和成瘤,并抑制细胞凋亡。总之,本部分研究表明miR-525-5p可通过靶向HSPA9抑制TET进展。第二部分:LncRNALOXL1-AS1靶向miR-525-5p/HSPA9促进胸腺肿瘤进展方法:生物信息学技术评估LOXL1-AS1在TET中的表达水平;qPCR技术检测70例TET组织（42例TM组织和28例TC组织）和30例正常胸腺组织中LOXL1-AS1的表达差异;WB评估HSPA9蛋白表达;应用慢病毒shRNA感染实现LOXL1-AS1下调;双荧光素报告基因实验评估miR-525-5p和LOXL1-AS1之间的关系;CCK-8、流式细胞术、Transwell小室实验分别用来评估LOXL1-AS1/miR-525-5p对TET细胞Ty-82、Thy0517增殖活性、凋亡、侵袭能力的影响。所有实验均进行三次重复实验,最终结果以均数±标准差（x±SD）表示。Student’s t检验和one-way ANOVA分别用来分析2组和多组间的数据差异。LOXL1-AS1的表达水平与TET患者总生存时间之间的关系评定用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验实现。皮尔森相关检验用来分析TET组织样本中LOXL1-AS1、miR-525-5p和HSPA9三者表达水平之间的相关性。结果均运用SPSS21.0（SPSS,Chicago,IL,USA）统计学软件进行统计。当P值小于0.05时差异具有统计学意义。结果:1.LOXL1-AS1在TET中的表达水平同正常组织相比呈升高状态;2.同LOXL1-AS1低表达的TET患者相比,LOXL1-AS1的高表达组TET患者的生存时间减少;3.LOXL1-AS1在TET组织中的含量同miR-525-5p的含量呈现负相关的关系,而与HSPA9的含量呈正相关关系;4.荧光素酶报告基因实验和WB实验结果表明,LOXL1-AS1可通过靶向miR-525-5p而促进HSPA9的翻译;5.CCK-8 结果显示,较 sh-NC+inhibitor-NC 组相比,sh-LOXL1-AS1+inhibitor-NC组细胞活性明显降低,而sh-NC+inhibitor-miR-525-5p组细胞活性升高;较 sh-LOXL1-AS1+inhibitor-NC 组相比,sh-LOXL1-AS1+inhibitor-miR-525-5p 组细胞活性升高;6.流式细胞术结果显示,sh-LOXL1-AS1+inhibitor-NC 组较 sh-NC+inhibitor-NC 组相比,细胞凋亡率升高,而 sh-NC+inhibitor-miR-525-5p 组较 sh-NC+inhibitor-NC组相比细胞凋亡率降低;较sh-LOXL1-AS1+inhibitor-NC组相比,sh-LOXL1-AS1+inhibitor-miR-525-5p 组细胞凋亡率降低;7.Transwell 侵袭小室实验结果显示,sh-LOXL1-AS1+inhibitor-NC 组较 sh-NC+inhibitor-NC组相比细胞侵袭数量降低,而sh-NC+inhibitor-miR-525-5p组细胞侵袭数量升高;较 sh-LOXL1-AS1+inhibitor-NC 组相比,sh-LOXL1-AS1+inhibitor-miR-525-5p组细胞侵袭能力增强。8.体内荷瘤实验结果显示,sh-LOXL1-AS1+inhibitor-NC组较sh-NC+inhibitor-NC组相比肿瘤体积降低,而sh-NC+inhibitor-miR-525-5p组肿瘤体积升高;较 sh-LOXL1-AS1+inhibitor-NC 组相比,sh-LOXL1-AS1+inhibitor-miR-525-5p 组肿瘤体积升高。结论:LOXL1-AS1在TET中高表达,与不良预后相关;抑制LOXL1-AS1的表达通过靶向miR-525-5p抑制细胞增殖和侵袭,诱导细胞凋亡。总之,本部分研究表明LOXL1-AS1可通过靶向miR-525-5p/HSPA9促进TET进展。