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玉米不仅是世界主要的食饲兼用作物,也是重要的工业原料。干旱是影响玉米生产最重要的非生物胁迫因素,因此挖掘耐旱基因并应用于分子育种具有重要意义。本课题组前期通过遗传连锁定位到一个干旱相关的QTL,结合基因表达数据筛选到干旱响应基因ZmSKIP。在拟南芥中的研究中表明,SKIP基因作为剪接体的组成部分,通过参与pre-RNA（前体mRNA）的可变剪接和基因表达调控,在植物胁迫应答响应过程中发挥重要作用。为研究SKIP在玉米响应干旱胁迫过程中的作用,本研究首先比较了ZmSKIP表达的时空特异性,发现其在耐旱自交系与干旱敏感自交系中表达差异显著。因此,分别克隆对应材料中ZmSKIP基因的启动子序列,并转化烟草和拟南芥通过GUS组织化学染色和荧光定量PCR分析,初步验证其特异启动子的功能。为研究ZmSKIP的功能,克隆ZmSKIP基因的全长cDNA序列并转化烟草叶片进行目的基因亚细胞定位。构建ZmSKIP过表达载体,同时转化拟南芥、skip-1突变体,并在玉米中进行遗传转化,比较转基因阳性植株与野生型在不同水分条件下的表型差异,初步分析ZmSKIP的功能,并对转基因过表达玉米进行了转录组测序分析。主要结果如下:1.ZmSKIP基因qRT-PCR组织表达分析表明:ZmSKIP在玉米的各个组织均有表达,其中在穗上叶表达量最高。对20%PEG处理的玉米耐旱及干旱敏感自交系中检测ZmSKIP基因的表达水平发现:在耐旱材料中,ZmSKIP的表达受胁迫诱导后表达量显著增加。分析不同激素处理下ZmSKIP基因的响应情况,结果显示ZmSKIP能够响应ABA、ETH的处理,但对GA和IAA的处理不响应。2.分别从玉米耐旱材料和干旱敏感材料中克隆得到ZmSKIP的启动子序列（p-ZmSKIP-P1:1393 bp,p-ZmSKIP-P2:1233 bp）,在线预测表明ZmSKIP启动子序列上含有ABRE、ARE、MYB等多个与逆境响应及光响应相关的顺式作用元件。3.ZmSKIP的启动子能够响应非生物胁迫。将ZmSKIP的启动子与GUS报告基因融合,利用烟草叶片瞬时表达系统,GUS染色结果表明ZmSKIP的启动子序列具有转录活性,且耐旱材料启动子活性显著高于干旱敏感材料。对转基因拟南芥GUS染色的结果表明叶、茎、花、果荚均能染色,与ZmSKIP可多个组织中均可表达的结果一致。对甘露醇和NaCl胁迫处理条件下转基因拟南芥的GUS定量结果表明,在胁迫处理条件下GUS表达量上升。4.ZmSKIP基因启动子上160 bp的差异可能与材料的耐旱性相关。结合共表达网络分析本研究筛选出了一个可能与该差异相关的MYB转录因子MYBR63,猜测MYBR63可与ZmSKIP启动子结合调控ZmSKIP的表达,进而影响了不同玉米自交系的耐旱性。5.克隆了ZmSKIP基因的全长cDNA序列,共1830 bp,构建CaMV35S::ZmSKIP:e GFP的融合表达载体,并利用农杆菌介导法瞬时转化烟草叶片,结果显示ZmSKIP蛋白定位于细胞核及核小体。6.过表达ZmSKIP能够提高拟南芥对非生物胁迫的抗性。过表达ZmSKIP的转基因拟南芥植株在甘露醇和NaCl胁迫下的发芽率显著高于野生型,在干旱胁迫条件下的耐旱性及存活率高于野生型植株。进一步利用qRT-PCR和RT-PCR分析了干旱胁迫下植株逆境相关基因的表达及剪接形式,发现与野生型相比AtDREB、AtRD29B基因在干旱胁迫的过表达材料中表达量显著增加并且AtRD29B的剪接形式发生改变,AtLEA、AtPOD基因的表达量显著下降,而AtAPX的表达水平没有显著差异,这些结果说明ZmSKIP可能通过调控AtDREB、AtRD29B等基因的表达提高植物的耐旱性。7.ZmSKIP能回复拟南芥skip-1突变体的表型。利用CaMV35S:ZmSKIP过表达载体通过农杆菌介导法对拟南芥突变体进行互补验证,结果表明skip-1/35S:ZmSKIP株系的发芽率、地下和地上部分的生长情况均与野生型相似。ZmSKIP能够在一定程度上恢复突变体各方面的表型,说明其与AtSKIP基因功能相似。8.在玉米中过表达ZmSKIP后能提高植株耐旱性,但是不影响正常条件下的产量相关性状。在三叶一芯期观察过表达材料与野生型的生长势,发现与过表达受体材料CO1相比ZmSKIP过表达后植株根长、根总面积显著高于CO1。五叶一芯期在土壤中进行抗旱性鉴定,结果表明过表达材料的耐旱性强于CO1。在果穗方面过表达材料与CO1相比在穗重、穗粗、穗行数、百粒重、粒长、粒宽等指标没有显著差异。9.ZmSKIP过表达转基因玉米转录组测序结果显示大量基因的表达发生了变化。共统计了44842个基因,其中显著应答的有889个,上调的有320个,下调的有569个,检测到46161个可变剪接事件,10457个AS基因有1360个显著AS事件,涉及961个基因,但上下调基因和差异剪切基因仅10个基因重叠。