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背景:卵巢癌是女性生殖系统常见的致死性恶性肿瘤。卵巢癌黏膜组织来源复杂,约90%为上皮性卵巢癌。约75%的卵巢癌患者为高级别上皮性卵巢癌,起病迅速,极具侵袭性,常伴随广泛的盆腹腔转移,预后极差,机制不明。自噬是一种溶酶体依赖的自然降解过程,主要通过降解细胞自身组分来维持细胞稳态。自噬究竟发挥促癌或是抑癌效应与肿瘤不同遗传背景及进展阶段相关。本课题组前期研究发现March5,ALKBH5等可通过上调自噬进而促进上皮性卵巢癌增殖,侵袭和转移,自噬在上皮性卵巢癌中可能发挥促癌效应。环状RNA(circRNAs)是一类特殊的非编码RNA,其共价闭环结构,耐受RNA酶降解,稳定性强。环状RNA可通过吸附微小RNA(micro RNAs)、调节蛋白与RNA相互作用和开环表达等方式在多种生理功能中发挥作用。研究表明环状RNA可通过调控自噬参与多种肿瘤的恶行生物学行为。本课题组前期研究发现CircMUC16通过调控上皮性卵巢癌自噬进而影响上皮性卵巢癌恶性生物学行为。本课题组前期采用Torin1(10μM)构建上皮性卵巢癌细胞(SKOV3)自噬模型,采用新一代测序技术转录组学分析,发现了504个明显上调的环状RNA,其中CircEEF2(hsa_circ_0048559)表达显著上调。本课题将探讨CircEEF2在上皮性卵巢癌中对自噬、增殖和侵袭的影响及可能的机制,以期寻找上皮性卵巢癌治疗新靶点,为自噬抑制在临床的应用提供理论依据。目的:(1)探讨CircEEF2在上皮性卵巢癌组织的表达与临床病理特征的相关性;(2)探讨CircEEF2对上皮性卵巢癌细胞自噬增殖,侵袭的影响;(3)探讨CircEEF2调控上皮性卵巢癌自噬发生的机制。方法:(1)针对CircEEF2设计divergent primer和convergent primer,采用q PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定其环性和全长,Sanger测序确认CircEEF2反向剪切位点。采用荧光原位杂交技术(FISH)观察CircEEF2上皮性卵巢癌标本组织的定位,通过Image J分析荧光强度。(2)转染CircEEF2沉默及过表达慢病毒,构建稳定转染细胞株,q RT-PCR检测CircEEF2沉默及过表达效率。采用western blot检测自噬相关蛋白标记物LC3II及P62的表达;采用m RFP-GFP-LC3慢病毒追踪自噬流的变化;引入3MA和巴夫洛霉素,分别阻滞自噬早期和晚期进程,WB检测LC3II的表达。(3)采用Ed U实验检测细胞增殖能力;采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;(4)构建裸鼠皮下成瘤模型,评估沉默或过表达CircEEF2对裸鼠皮下成瘤的影响;在沉默CircEEF2后同时予以自噬抑制剂氯喹腹腔注射,观察抑制自噬对移植瘤的影响;(5)采用生物信息学分析(Miranda v3.3a;Targetscan human 7.2)双荧光素酶报告基因验证CircEEF2与mi RNA及mi RNA与下游靶基因的相互结合作用;采用western blot检测下游靶基因的表达;(6)通过RNA-pulldown,聚丙烯酰胺凝胶电泳及基质辅助激光解析/串连飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)实验寻找与CircEEF2直接结合的蛋白;western blot检测CircEEF2对直接结合蛋白的调控作用。结果:(1)CircEEF2的divergent primer只能以c DNA为模板扩增出条带而不能以g DNA为模板扩增出条带。Sanger测序结果确认反向剪切位点序列。FISH实验表明,CircEEF2在上皮性卵巢癌组织中主要定位于细胞浆。CircEEF2在上皮性卵巢癌组织中的表达高于正常卵巢组织。CircEEF2的表达与患者年龄分布无统计学意义;CircEEF2在上皮性卵巢癌组织的表达越高,肿瘤分期分级越高。(2)沉默CircEEF2,LC3II表达下调,P62表达上调,抑制自噬流;过表达CircEEF2,LC3II表达上调,P62表达下调,促进自噬流;过表达CircEEF2,促进A2780细胞自噬,增殖及侵袭;在过表达CircEEF2细胞株中抑制自噬,细胞增殖及侵袭能力减弱;(3)CircEEF2可能通过吸附mi R-6881-3p进而上调自噬关键基因ATG5及ATG7的表达;CircEEF2可能与ANXA2直接结合进而抑制p-m TOR的激活。结论:(1)CircEEF2在上皮性卵巢癌细胞株SKOV3及A2780中反向剪切成环。CircEEF2在上皮性卵巢癌组织中表达上调且与上皮性卵巢癌分期分级相关;(2)过表达CircEEF2促进上皮性卵巢癌细胞自噬,增殖及侵袭;且自噬可能发挥促癌效应;(3)CircEEF2可能通过调控mi R-6881-3p/ATG5/ATG7轴及直接结合ANXA2进而抑制p-m TOR的激活调控上皮性卵巢癌细胞自噬的发生。