胰腺导管腺癌（PDAC）是一种恶性程度极高的消化道肿瘤,PDAC癌组织缺乏血管供给,肿瘤组织发生纤维化改变,同时肿瘤内部一系列代谢改变,使得胰腺癌至今治疗方法十分匮乏,使其获得“癌中之王”称号。全世界肿瘤患者中,PDAC的预后极差,五年存活率不足5%,这与PDAC起病隐匿、早期诊断困难以及缺乏有效治疗方式等有关。而对于PDAC在人体内发生发展的机制研究,能够为解决以上问题提供重要依据。有研究发现I型酸性上皮角蛋白家族成员Keratin 17（K17）在胰腺癌中呈高表达状态,但是对K17在胰腺癌中可能扮演的功能角色及相关分子机制未见报道。而K17可以通过影响Akt/m TOR信号通路的表达来对细胞增殖修复过程产生显著影响,同时可以通过影响Th1/Th2免疫平衡偏移来对表皮细胞修复的进展产生影响。胰腺导管腺癌作为恶性肿瘤的一种,已被证实其发生发展过程与局部免疫平衡状态密切相关;此外,反复细胞损伤后修复也被发现是胰腺癌进程中的重要环节。而这两个方面的机制均与K17现已知的功能机制相关。因此本课题以K17为研究重点,深入探讨K17在PDAC中的影响作用及机制,为胰腺导管腺癌（PDAC）的治疗提供新的靶点,探讨K17作为PDAC诊断及预后肿瘤标志物的可能性。一、角蛋白17在胰腺导管腺癌临床样本中的研究目的通过检测角蛋白17在胰腺导管腺癌（PDAC）数据库及临床样本中的表达水平,并分析其与患者临床病理特征以及预后的相关性,探讨K17作为PDAC诊断以及生存预后分子标志物的可能性。方法我们将数据库中K17 mRNA在癌和癌旁组织中的表达水平进行数据统计分析,同时通过免疫组化实验检测PDAC临床样本中K17在癌组织以及配对癌旁组织中的表达水平,分析K17的表达与患者临床病理特征以及预后的相关性。结果在癌和癌旁组织对比中,PDAC样品中K17 mRNA的表达明显高于癌旁组织（P<0.001）。而高K17 mRNA水平的患者的总生存期较短（P<0.005）。K17蛋白在PDAC癌组织中的表达水平高于癌旁组织（P<0.005）。K17蛋白表达上调与病理学分级显着相关（P<0.005）。生存分析发现:K17蛋白表达高的PDAC患者的预后显著更差（P<0.001）,总体生存的独立预后因素有:病理分级,淋巴结转移和上调的K17表达。结论在PDAC癌组织中,K17异常高表达,与癌旁组织相比,表达明显增高,并且K17的表达与患者预后相关,高表达的K17提示预后更差。因此,K17可能成为一个潜在的用于PDAC的临床诊断和预后判断的肿瘤分子标志物。二、角蛋白17在胰腺导管腺癌中的作用及机制研究目的通过基因沉默和过表达技术,探讨K17在PDAC细胞中的生物学功能及作用机制。方法构建携带K17干扰序列和过表达序列的慢病毒。分别检测K17蛋白在SW1990、CFPAC-1、HPDE6-C7和PANC-1细胞株中表达水平,通过转染携带过表达序列及干扰序列的慢病毒,构建稳定的细胞系。通过免疫荧光和Western blot分别验证K17在PDAC细胞中的沉默和过表达效率。利用CCK-8细胞增殖实验和细胞平板克隆实验检测K17表达对PDAC细胞增殖的影响;利用Transwell小室侵袭实验检测K17对PDAC细胞侵袭能力影响,划痕实验检测K17对PDAC细胞迁移能力的影响。为检测K17在体内对PDAC细胞增殖的影响,进行体外裸鼠皮下移植瘤实验。流式分析检测K17表达对PDAC细胞周期和细胞凋亡的影响;利用Western blot试验方法检测K17对Cyclin D1和Caspase3表达的影响。利用q PCR及免疫荧光试验方法检测E-钙黏蛋白及波形蛋白的表达,检测K17在PDAC细胞中对上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的调节。结果K17在4种PDAC细胞株中均存在高表达。通过转染慢病毒在SW1990和CFPAC-1细胞中成功沉默K17的表达,并在HPDE6-C7和PANC-1细胞中成功过表达K17。CCK-8细胞增殖实验和细胞平板克隆实验结果显示:沉默K17表达后PDAC细胞的增殖受到明显增强,过表达K17后细胞增殖能力明显抑制（P<0.01）。划痕实验结果提示K17表达沉默后PDAC细胞的迁移得到明显增强,过表达K17后得到相反结果（P<0.01）。Transwell小室侵袭实验结果显示:沉默K17后PDAC细胞的侵袭能力得到明显增强,过表达K17后细胞侵袭能力明显抑制（P<0.01）。裸鼠皮下成瘤实验发现沉默K17表达后PDAC细胞在皮下病灶明显大于阴性对照组,同时发现更多的Ki67阳性细胞（P<0.05）。细胞周期检测发现:K17表达沉默后,PDAC细胞G1和G2期的数量增加,S期的细胞数量减少,过表达K17后,PDAC细胞G1和G2期的数量减少,S期的细胞数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。细胞凋亡检测结果发现:K17表达沉默后PDAC细胞凋亡明显减少,过表达K17显著增加PDAC细胞凋亡（P<0.01）。Western blot检测提示:过表达K17抑制PDAC细胞中Cyclin D1蛋白表达,促进Caspase3蛋白表达（P<0.01）;K17表达沉默促进PDAC细胞中Cyclin D1蛋白表达,CFPAC-1细胞中Caspase3表达减少（P<0.01）,对SW1990细胞Caspase3表达影响不明显（P>0.05）。沉默K17蛋白表达明显促进PDAC细胞EMT,E-cadherin mRNA表达降低,Vimentin mRNA表达增加（P<0.01）;过表达K17,PDAC细胞EMT发生了明显逆转,E-cadherin表达增加,Vimentin表达抑制（P<0.01）。与免疫荧光检测中观测到结果一致。结论（1）过表达K17可以对PDAC细胞增殖起抑制作用,同时PDAC细胞的侵袭以及迁移能力也得到抑制;（2）下调Cyclin D1表达来抑制细胞周期进程,增加癌细胞凋亡水平可能与上调凋亡蛋白Caspase3表达有关;（3）过表达K17可以逆转PDAC细胞EMT。因此,K17在PDAC中发挥重要的抑癌作用。