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在全球范围内,肝癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）是最常见的致命恶性肿瘤。患者往往在晚期被诊断为肝癌,无法及时接受手术治疗,导致其预后不良,而长期使用化疗药物,如索拉非尼,会损害正常细胞且治疗效果不理想,对于肝癌患者来说,需要探索新的治疗方案或治疗药物。天然化合物作为肝癌治疗的候选药物或许可以为患者提供更好的疗效,并降低全身毒性和副作用,预后更好。家蝇抗菌肽Cecropin（Musca domesticacecropin,Mdc）具有良好的抗菌、抗肿瘤和抗病毒等作用,抗菌肽M1-8是Mdc的衍生肽,由Mdc的第1-8位氨基酸和第一个螺旋构成。本课题拟以M1-8为研究对象通过体内外抗肿瘤实验研究其对肝癌的作用,并围绕自噬-凋亡途径对抗菌肽M1-8的抗肿瘤机制作进一步研究与探讨,旨在为肝癌的研究发掘新型廉价低毒性的小分子抗肿瘤候选药物分子,也为抗菌肽的应用研究提供理论与实验支撑。研究方法:1、Mdc构效关系研究及衍生肽的筛选采用Prot Param分析肽的化学和物理参数;使用Ex PASY数据库中的protscan程序对Mdc序列的亲疏水性进行分析。MTT实验筛选五种衍生肽对十种不同癌细胞的抗肿瘤活性。MTT检测衍生肽对正常细胞株NCM460、Chang Lveri的毒性作用。溶血实验检测衍生肽的溶血活性。2、抗菌肽M1-8的体外抗癌作用及机制研究以Hep G2细胞为模型,观察给药后细胞增殖、迁移、凋亡和自噬情况,细胞形态及微观结构的变化。采用激光共聚焦观察药物在细胞中的定位;应用免疫组化方法检测肿瘤组织溶酶体相关分子、自噬相关分子和凋亡相关分子表达;免疫荧光检测溶酶体组织蛋白酶Cathepsins D的表达;Real-time PCR和Western Botl检测M1-8对Hep G2细胞中自噬和凋亡相关基因和蛋白LC3B,cathepsins D,P62;Bax,Bcl-2,P53,caspase3等的影响;采用JC-1染色观察M1-8对线粒体膜电位的影响。3、抗菌肽M1-8的体内抗肝癌作用及机制研究通过构建肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,皮下注射给药,给药期间监测裸鼠整体状态,测量裸鼠肿瘤体积和生长速度,给药周期结束后对肿瘤重量进行分析,结合HE染色、IHC及蛋白免疫印迹等实验考察M1-8体内抗肿瘤作用及分子机制。研究结果:1、Mdc构效关系研究及衍生肽筛选Mdc为阳离子抗菌肽,分别在位于Mdc序列的1-6、9-21、27-39处形成3个α-螺旋结构,和典型天蚕素抗菌肽相比Mdc的螺旋间没有丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸（Ala-Gly-Pro）结节部。从成熟肽序列中分别截取1-6、1-7、1-8、9-21、27-39位氨基酸分别合成五种衍生肽M1-6、M1-7、M1-8、M9-21、M27-39。这五个衍生肽的二级结构中都包含了α-螺旋,其中M1-6、M9-21、M27-39分别为Mdc的三个α-螺旋,而M1-7是在第一个α螺旋的基础上多了一个甘氨酸残基（Gly,G）,M1-8是在第一个α-螺旋的基础上增加了甘氨酸（Gly,G）、赖氨酸（Lys,K）。和其它抗菌肽相比M27-39的预测半衰期最长,它的疏水性氨基酸比例也明显高于其他多肽。衍生肽中M1-8的稳定性最强,M9-21最弱,这可能与抗菌肽的N端结构有关,M9-21在N端的第一个氨基酸残基为赖氨酸,这或许是导致其不稳定性最大与半衰期最短的原因。MTT实验结果表明M1-6对Hela、SH-SY5Y、A2780、HGC-27四株癌细胞具有抑制作用;M1-7对PC-12、MCF-7、SH-SY5Y、A2780、Hela、CNE-2五株癌细胞具有抑制作用;M1-8对Hep G2、MCF-7、PC-12、HCT116、A549、A2780六株癌细胞具有抑制作用;M9-21对Hep G2、PC-12、HCT116、SH-SY5Y四株癌细胞具有抑制作用;M27-39对Hep G2、MCF-7、PC-12、Hela、HCT116、A549、CNE-2、HGC-27八株细胞具有抑制作用。同时,五种衍生肽对正常肠上皮细胞NCM460和正常肝细胞Chang Lveri都无明显毒性,对两种来源的红细胞均不产生明显的溶血反应。2、抗菌肽M1-8的体外抗癌作用及机制研究MTT和划痕结果显示M1-8能抑制细胞的增殖和侵袭能力。激光共聚焦观察到药物富集于Hep G2细胞的溶酶体。溶酶体染色结果显示,M1-8能破坏溶酶体的结构和PH值,能促进溶酶体蛋白酶D从溶酶体中释放,同时抑制细胞自噬流。对细胞形态的研究结果表明M1-8能破坏正常肝癌细胞形态,使细胞膜发生皱缩变形,给药后自噬体数量累积,并且会导致细胞内出现大量囊泡样结构。M1-8能增强细胞内自噬标志性蛋白LC3B的表达,同时上调P62蛋白,M1-8还可引起凋亡相关蛋白BAX、Caspase-3及P53蛋白的上调,Bcl-2蛋白下调。FCM和Hochest染色结果表明M1-8能促进细胞凋亡,JC-1染色结果显示M1-8能导致线粒体膜电位的下降。3、抗菌肽M1-8的体内抗肝癌作用及机制研究体内实验结果显示M1-8能抑制裸鼠皮下移植瘤的增殖,给药后肿瘤组织中LC3B和P62蛋白的表达上升。此外M1-8还可增加肿瘤组织凋亡相关蛋白BAX、Caspase-3及P53蛋白的表达,降低Bcl-2蛋白的表达。对脏器的HE染色结果表明M1-8对裸鼠的心、肝、脾、肺、肾无明显毒副作用。结论:筛选获得的抗菌肽M1-8具有良好的疏水性和稳定性,对正常细胞安全性高,无明显的细胞毒性,不易导致溶血反应,对裸鼠脏器无明显毒性。M1-8在体内外能显著抑制肝癌细胞的生长,具体机制可能与M1-8在进入细胞后富集于溶酶体,阻止自噬体和溶酶体的融合,使自噬小体大量累积;同时组织蛋白酶D的释放使线粒体膜电位发生变化,导致细胞凋亡有关。