【摘 要】
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目的:高血压（Hypertension）引起的中风和心、肾组织损伤是心血管疾病死亡的重要原因。其病理特征是动脉壁增厚、管腔变窄及血管壁内炎症细胞浸润。目前临床上药物治疗效果不理想,因此,探究高血压发病的新机制、治疗靶点以及新药的发掘尤为迫切。研究证实CD4+T细胞,特别是Treg/Th17细胞的失衡是高血压引起的组织损伤的重要机制之一。Treg细胞可与Th17细胞功能上相互拮抗,发挥抑制性免疫调节
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目的:高血压（Hypertension）引起的中风和心、肾组织损伤是心血管疾病死亡的重要原因。其病理特征是动脉壁增厚、管腔变窄及血管壁内炎症细胞浸润。目前临床上药物治疗效果不理想,因此,探究高血压发病的新机制、治疗靶点以及新药的发掘尤为迫切。研究证实CD4+T细胞,特别是Treg/Th17细胞的失衡是高血压引起的组织损伤的重要机制之一。Treg细胞可与Th17细胞功能上相互拮抗,发挥抑制性免疫调节作用。而AMPK信号通路的激活则调控Treg细胞的分化和免疫功能。不同因素诱导的高血压模型都证实上调Treg细胞数量及其功能和抑制Th17细胞能减轻血管壁等组织的炎症细胞募集、胶原沉积,进而减轻高血压的组织损伤。但调控Treg/Th17细胞平衡的机制还远未阐明。Slit2是一种神经分泌蛋白,参与调控白细胞迁移等过程,我们前期证实Slit2过表达改善高盐诱导的ANP-/-盐敏性高血压模型的心血管组织损伤,且伴随血管壁中Treg细胞数量增加和Th17细胞的减少。因此,本课题利用ANP-/-和ANP-/-;Slit2-Tg小鼠,进一步探究Slit2过表达是否通过AMPK信号通路调控Treg/Th17细胞平衡的分子机制。方法:（1）ELISA方法检测高盐饮食诱导的ANP-/-高血压模型小鼠血清中Slit2水平,进一步明确盐敏性高血压与Slit2的关系;（2）采用流式细胞仪检测外周血和脾脏Treg和Th17的数量,明确Slit2过表达与外周血和脾脏Treg/Th17细胞数量的关系;（3）流式细胞仪检测Slit2过表达对体外诱导Treg/Th17细胞分化的影响;（4）流式细胞仪和Q-PCR检测Treg细胞分泌的细胞因子水平;（5）采用CFSE细胞增殖实验观察Treg细胞对Na（?）ve效应T细胞增殖的抑制作用;（6）转录组（RNA-Seq）测序明确Slit2过表达调控的Treg细胞代谢相关的关键信号通路;（7）通过Seahorse XF细胞能量代谢分析明确两种小鼠Treg细胞代谢途径的差异;（8）使用Mito Tracker-Red染色和透射电镜方法观察Treg细胞中线粒体结构变化;（9）流式细胞仪检测Treg细胞内线粒体ROS的产生;（10）Q-PCR验证Treg细胞线粒体功能指标和Treg细胞关键分泌因子的表达;（11）Western Blot技术和流式检测两种小鼠Treg细胞特征性蛋白表达及相关信号通路蛋白的磷酸化;结果:（1）高盐饮食诱导4W后ANP-/-小鼠血清中Slit2含量明显降低;（2）Slit2过表达上调高盐饮食后脾脏和外周血中的Treg细胞;（3）在正常浓度Na Cl诱导和高浓度Na Cl诱导下,Slit2过表达不影响两种小鼠的体外诱导的Treg/Th17分化;（4）Slit2过表达上调Treg细胞分泌的抑制炎症因子（TGF-β）的表达和下调炎症因子（IL-6、IL-13）的表达;（5）Slit2过表达可明显上调Treg细胞对Na（?）ve效应T细胞增殖的抑制作用;（6）Slit2过表达增加线粒体内膜蛋白ANT4的表达;（7）Slit2过表达促进Treg细胞的氧化磷酸化和脂肪酸氧化途径;（8）Slit2过表达后减轻高盐诱导所致的ANP-/-小鼠来源Treg细胞线粒体肿胀和体积膨大,同时减少线粒体在高盐诱导时所致的空泡样改变;（9）Slit2过表达明显降低Treg细胞线粒体内ROS的产生;（10）Slit2过表达影响高盐诱导后Treg细胞线粒体中（Nrf1、Fis1、Cytb-CIII等）指标的表达;（11）Slit2过表达促进Treg细胞内AMPK的表达和磷酸化。结论:初步证实Slit2过表达可能通过活化Treg细胞中AMPK上调ANT4的表达并促进Treg细胞线粒体的氧化磷酸化与脂肪酸氧化进而改善Treg细胞线粒体结构和功能,增强Treg的抑制功能和减少促炎因子的分泌从而调控Treg/Th17的平衡。
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