猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）属于动脉炎病毒科（arteriviridae），动脉炎病毒属(arterivirus)，同属的还有马动脉炎病毒（equine arteritisvirus, EAV）、小鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)和猴出血热病毒(simian hemorrhagic fever virus,SHFV)。根据血清型和遗传特性的差异,可将PRRSV划分为两个基因型，即欧洲(I)型和美洲(II)型。ORF5a是最新发现的在动脉炎病毒中普遍存在的一个ORF,其表达的5a蛋白也已经在PRRSV和EAV中被证实为第8个结构蛋白。目前对5a蛋白的结构与功能知之甚少，本研究在实验室已有的PRRSV全长感染性克隆的基础上，利用反向遗传操作对5a蛋白的结构与功能进行解析，为更加全面的认识5a蛋白及动脉炎病毒奠定理论基础，同时为开发基因标记疫苗提供了理论依据和基础材料。1. PRRSV5a蛋白结构与功能的研究II型PRRSV的ORF5a由141或156个核苷酸组成，其编码的5a蛋白分别包括46或51个氨基酸。按照ORF5a的读码框分析其后面的序列，发现在其终止密码子后还有若干个终止密码子。在全长感染性克隆pAJX25HB的基础上，通过定点突变PCR的方法，改变ORF5a的终止密码子，从而延长或缩短5a蛋白。结果表明，5a蛋白最多可延长45个氨基酸，但是延长的5a蛋白不稳定，突变位点发生回复突变，说明5a蛋白仍偏好使用其原来的终止密码子终止翻译。通过观察细胞病变情况发现5a蛋白的延长影响病毒的复制能力，继续延长5a蛋白则不能拯救到病毒粒子。另外，5a蛋白不能缩短，46个氨基酸是5a蛋白的最短长度。同时，间接证明5a蛋白对II型PRRSV的复制是必需的，它在病毒的出芽和包装过程中发挥作用。2.两型PRRSV嵌合分离ORF5a/ORF5重叠区的研究ORF5a大部分序列与ORF5重叠甚至完全存在于ORF5中，给单独研究5a蛋白的结构与功能带来极大的不便。为了能更方便的研究PRRSV5a蛋白的结构与功能，本试验通过SOE-PCR的手段将欧洲型PRRSV的ORF2a-ORF5a替换入北美型PRRSV骨架中，成功将ORF5a从ORF5中独立出来。通过对构建的cDNA克隆进行分子生物学及病毒学分析表明，I型PRRSVORF2a-ORF5a序列能稳定存在于嵌合病毒基因组内，表达的相应蛋白也能在II型PRRSV中发挥同样的功能，病毒的生长特性与亲本毒相似。本研究首次将PRRSV的ORF5a序列从ORF5中独立出来，为进一步研究5a蛋白的结构与功能提供了理论依据和基础材料。3. pAPRRS-LDV嵌合体的构建及其生物学特性已有前人研究证明，EAV的囊膜蛋白编码基因ORF2–ORF4替换PRRSV的相应区域，能够产生感染BHK-21细胞的嵌合PRRSV感染性克隆。通过SOE-PCR的方法将LDV的ORF2-4替换pAPRRS的相应区域，以期产生能够感染小鼠的PRRSV嵌合感染性克隆pARRS-LDV234。通过转染BHK-21细胞发现，该嵌合克隆能够在细胞内完成亚基因组的转录和GP5及N蛋白的翻译,说明pARRS-LDV234具有生物学活性。pARRS-LDV234失去对Marc-145细胞的感染性（预期结果），但是未检测到对小鼠及小鼠腹腔巨噬细胞的具有感染性的病毒粒子，目前还没有找到能够培养pARRS-LDV234/LDV的传代细胞。本研究为PRRSV在小鼠体内进行活体培养提供了思路和方法。