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武汉野田村病毒(Wuhan Nodavirus, WhNV)是我们研究组2006年从武汉市武昌县甘蓝菜地的颗粒体病毒感染罹病的菜青虫中分离出一种新的病原病毒,对其理化性质和全基因组序列分析测定后,我们将其划为野田村病毒科的一个新成员。我们首先在大肠杆菌中表达纯化了三种WhNV蛋白ProA、B2和Proα,并制备了这三种蛋白的多克隆抗体。为了研究WhNV复制机制,我们用纯化的病毒在实验室条件下进行感染实验。分别用western blot检测蛋白、RT-PCR检测核酸和超微切片检测病毒粒子形成等三个层次证实纯化的WhNV在实验室条件下在原始宿主菜青虫体内能够高效增殖。Western blot结果显示菜青虫感染WhNV后会产生ProA、B2和Proα,而预测的B1蛋白则没有检测到。Northern blot分析证实WhNV在复制的过程中确实可以产生与RNA1 3’序列一致的亚基因组RNA3。由370个核苷酸组成的RNA3上只有一个ORF——ORF B2,而这个ORF有两个同框的起始密码子分别位于2795和2855位(以RNA1命名),这就提示WhNV可能在复制的过程中会产生两种形式的B2,B2-85和B2-65。点突变和western blot分析证实,WhNV RNA3在菜青虫来源的Pr-E细胞中只会利用其第一个AUG作为起始密码子产生B2-85蛋白,而不会产生B2-65蛋白。共转染实验证实WhNV B2能够和FHV B2蛋白一样在果蝇细胞S2内抑制dsRNA和siRNA诱导的RNAi,而且WhNV B2N端的1-20氨基酸区域对于这种抑制功能是必须的。同时,我们还在大肠杆菌中表达纯化了可溶性的WhNV B2,体外实验证明WhNV B2能够与dsRNA和siRNA结合,并且可以保护dsRNA免遭Dicer切割。于是我们推测,WhNV B2蛋白抑制RNAi的作用机制分为两步：第一,WhNVB2与dsRNA结合从而保护其免遭Dicer酶切割成siRNA;第二,WhNV B2也可与siRNA结合阻止其参与形成RNA诱导的沉默复合体。为了获得WhNV基因组RNA完整的序列信息,我们对WhNV基因组RNA的末端重新进行了序列测定。结果显示,WhNV基因组RNA 5’都有帽子结构,并对原有序列进行了修正,WhNV RNA1由3151个核苷酸组成,而RNA2由1572个核苷酸组成。根据修正的序列信息,我们构建了含有WhNV RNA1和RNA2全长序列的质粒pWhl [G,0]和pWh2 [G,0].在T7 RNA聚合酶的作用下,这两个质粒可以分别转录出有真实末端的WhNV RNA1和RNA2。RT-PCR证实在Pr-E细胞和Sf9细胞内无论RNA2存在与否,WhNV RNA1都可以自我复制。同时RT-PCR结果也证明由Pr-E细胞系、重组杆状病毒AcT7N、pWh1[G,0]和pWh2[G,0]组成的WhNV感染性cDNA克隆构建成功。