肌肉生长抑素（mystatin,MSTN）作为骨骼肌生长发育的负调控因子,其表达能够显著抑制肌肉的生长发育。MSTN基因在哺乳动物进化过程中高度保守,其功能缺失会引起动物体内肌肉过度生长,导致动物出现双肌（double muscle,DBM）表型。自然突变的MSTN基因已经在牛、绵羊、山羊、马、猪、狗、兔等动物中发现,通过基因编辑技术同样在许多物种中实现了MSTN基因的人工诱变。在现代家畜育种中,利用人工核酸酶技术介导MSTN基因突变产生双肌表型,可以提高家畜胴体产肉率。然而,具有“双肌”表型的动物由于体内肌肉异常增加,导致脂肪含量相对减少,直接影响肉的品质。脂肪型脂肪酸结合蛋白（adipose fatty acid-binding protein,FABP4）作为一种脂质蛋白伴侣,对长链脂肪酸具有高亲和力,促进其在细胞内的溶解和转运。研究发现,FABP4基因参与动物体内脂肪沉积,与皮下脂肪含量以及肌内脂肪（intermuscular fat,IMF）含量密切相关。与国外优质肉牛品种相比,我国本土肉牛品种产肉量较低,牛肉品质相对较差。为了解决这一问题,本研究通过基因编辑技术将与IMF沉积有关的FABP4基因定点整合到鲁西黄牛MSTN基因座,同时引入G938A点突变,借助内源性启动子实现FABP4基因在骨骼肌组织中的特异性表达,在提高胴体产肉量的同时增加体内IMF含量。本研究主要内容和结果如下:1.在小鼠MSTN基因终止密码子TGA位点附近筛选得到1个CRISPR/Cas9系统介导的sgRNA打靶位点,并构建相应的同源重组打靶载体,通过原核显微注射技术获得F0代阳性转基因小鼠。对转基因小鼠进行扩繁,通过Junction PCR、Long-range PCR以及Southern blot检测,鉴定出可用于后续表型研究的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的杂合子与纯合子转基因小鼠模型。2.分别取同日龄野生型小鼠、杂合子以及纯合子转基因小鼠进行解剖,全身主要部位肌肉形态对比发现,纯合子转基因小鼠具有明显的双肌表型。对主要脏器以及骨骼肌进行组织学检测,结果显示纯合子转基因小鼠双肌表型是由于肌纤维横截面积增大引起的。对骨骼肌组织中FABP4蛋白与甘油三酯含量进行检测,结果显示FABP4蛋白含量显著增加促进肌肉中甘油三酯的沉积。3.在鲁西黄牛MSTN基因座找到一个能够融合表达外源插入基因的区域,借助CHOPCHOP和Cas-OFFinder在线分析软件对该区域内所有sgRNA靶点进行了潜在脱靶位点统计与分析,初步筛选得到脱靶位点相对较少的4个候选sgRNA靶点。构建相应的CRISPR/Cas9切割载体,并在鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中进行切割活性检测与脱靶效应检测,最终确定sgRNA1靶点具有相对较高的切割效率,同时对应的20个潜在脱靶位点中均未发生脱靶效应。4.针对sgRNA1靶点,构建了定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变同源重组打靶载体,并与相应的CRISPR/Cas9切割载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,应用嘌呤霉素进行克隆细胞筛选。通过Junction PCR、Long-range PCR以及Southern blot检测鉴定出6株双等位基因打靶的阳性单克隆细胞。5.以上述阳性单克隆细胞作为核移植供体细胞,利用体细胞核移植技术获得转基因克隆胚胎,对随机挑选的转基因克隆胚胎进行PCR检测,排除供核细胞中混有非基因打靶细胞的可能。对发育形态良好的克隆囊胚进行胚胎移植,截至目前共计19头受体牛维持妊娠。综上所述,本研究通过构建定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因小鼠模型,验证MSTN基因纯合点突变能够引起动物产生双肌表型,FABP4基因特异性表达能够增加骨骼肌组织中的甘油三酯含量。同时,应用CRISPR/Cas9系统进行定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因肉牛的生产,为我国高产优质肉牛新品种的培育提供重要育种材料。