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目的:白英(solanum lyratum thumb SLT)为传统中药已有2000多年的历史,具有清热利湿、消肿解毒之功效,是常用的抗癌中草药,临床上多用于肝癌、脑癌、肺癌、宫颈癌、胃癌、鼻咽癌、声带癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、肾盂癌、膀胱癌、前列腺癌、绒毛膜上皮癌等多种癌症的治疗。迄今为止,白英的抗肿瘤作用机制及其活性成分尚未完全明确,而且对白英抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡方面的研究,国内外文献报道较少。本研究探讨白英醇提物抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖效应和诱导SMMC-7721细胞凋亡及其分子机制,为临床应用提供实验依据。
方法:1.取白英干品50克,搅碎,采用浸渍法,抽滤,浓缩获取白英醇提物。
2.体外培养人肝癌SMMC-7721细胞,实验随机分为正常对照组、白英醇提物处理组(浓度分别为5、10、20mg/ml)和阳性对照组(顺铂,浓度为20 mg/L)。
3.采用四唑盐(MTT法)检测人肝癌SMMC-7721细胞存活和生长,绘制人肝癌SMMC-7721细胞生长曲线(MTT法)。
4.白英醇提物分别作用人肝癌SMMC-7721细胞24h、48h、72h和96h后,采用细胞毒(MTT法)实验检测肝癌细胞抑制率和IC50值。
5.白英醇提物作用人肝癌SMMC-7721细胞48h后,采用荧光显微镜观察人肝癌SMMC-7721细胞形态变化。
6.白英醇提物作用人肝癌SMMC-7721细胞48h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期变化。
7.白英醇提物作用人肝癌SMMC-7721细胞48h后,半定量RT-PCR测定基因bcl-2、bax、caspase-9、caspase-3的表达变化。
8.白英醇提物作用人肝癌SMMC-7721细胞48h后,测定caspase-3活性。
结果:1.人肝癌SMMC-7721细胞在细胞接种后的第2-6天出现对数生长期,第7天细胞数量开始下降。
2.白英醇提取物对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有较强的抑制作用,且这种作用呈一定的剂量和时间依赖性。5、10、20mg/ml SLT和DDP处理24h细胞抑制率分别为(17.365±0.535)％、(35.705±0.958)％、(51.876±1.684)％和(75.855±2.536)％,处理48 h细胞抑制率分别为(28.551±0.715)％、(47.106±1.386)％、(61.078±2.486)％和(85.105±1.349)％,处理72h细胞抑制率分别为(39.854±0.723)％、(58.213±1.479)％、(72.131±2.340)％和(92.258±2.514)％,处理96 h的细胞抑制率分别为(49.895±0.857)％、(65.354±2.158)％、(77.652±2.317)％和(97.358±2.957)％以上各组细胞抑制率与正常对照组比较均有显著差异(p<0.01)；白英醇提取物处理24h、48 h、72h和96 h的IC50分别为19.19、12.42、7.90和5.48mg/ml。
3.观察到细胞凋亡所特有的典型形态特征。形态学观察可见细胞核固缩、染色质凝集边聚、核断裂,凋亡小体等特征。
4.流式细胞仪检测结果显示,经5,10,20 mg/ml SLT醇提物、DDP处理组人肝癌SMMC-7721细胞凋亡率分别为(18.26±1.25)％、(26.24±3.12)％、(39.08±2.49)％,(58.25±5.56)％与正常对照组凋亡率(3.25±0.56)％比较均有显著差异(p<0.01)。G0/G1细胞比率分别为(36.35±6.20)％、(50.11±4.04)％、(59.23±1.68)％和(32.65±3.63)％,显著高于正常对照组(27.94±4.35)％(P<0.05或P<0.01)。
5.半定量RT-PCR检测结果显示,bcl-2mRNA表达下调而bax、caspase-9和caspase-3 mRNA表达上调。5、10、20 mg/ml SLT处理组bcl-2/β-actin光密度积分值之比分别为0.42±0.04、0.23±0.04、0.12±0.03与正常对照组0.62±0.04相比有显著差异(p<0.01)；bax/β-actin光密度积分值之比分别为0.35±0.04、0.56±0.05、0.72±0.05与正常对照组0.23±0.02相比有显著差异(p<0.05或P<0.01)；caspase-9/β-actin光密度积分值之比分别为0.46±0.02、0.55±0.03、0.73±0.03与正常对照组0.19±0.02相比有显著差异(p<0.01)。caspase-3/β-actin光密度积分值之比分别为0.35±0.02、0.55±0.03、0.68±0.03与正常对照组0.22±0.02相比有显著差异(p<0.01)。
6.caspase-3活性测定提示白英醇提物对肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程中caspase-3活性水平升高有一定的影响,三个不同浓度(5mg/ml、10mg/ml和20 mg/ml)白英醇提取物作用肝癌SMMC-7721细胞48h后,caspaes-3活性分别是0.72±0.08；0.88±0.10和1.25±0.10,均显著高于对照组(0.35±0.03)(P<0.01)。
结论:白英醇提取物对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有较强的抑制作用,且这种作用呈一定的剂量和时间依赖性。
1.白英醇提取物具有诱导SMMC-7721细胞凋亡作用,细胞凋亡率呈一定剂量和时间依赖性。细胞凋亡可能是白英抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖的机制之一。
2.白英醇提取物诱导SMMC-7721细胞凋亡的分子机制可能与上调bax、caspase-9和caspase-3基因表达和下调bcl-2基因表达及上调caspase-3活性有关。