研究背景:动静脉内瘘(Arteriovenous fistula,AVF)是维持性血液透析(Maintenance hemodialysis,MHD)患者首选的血管通路,被称为尿毒症患者的“生命线”。但调查显示,首次AVF的1年通畅率是60%,2年通畅率仅有51%,二次开放的AVF 1年通畅率是71%,2年通畅率则降至64%,是导致血液透析人群透析不充分、增加中心静脉导管使用、死亡率和高住院率的重要原因。目前临床上尚无有效措施防治AVF失功。因此,深入了解AVF狭窄、失功的发病机制,探索有效的防治策略,延长自体AVF的使用寿命,对提高MHD患者的长期生存率,改善生存质量有着重要的意义。AVF失功的机制包括:一、血管损伤:自体AVF成形术后,由于剪切应力改变、慢性炎症反应、缺氧、尿毒素及反复的透析穿刺引起血管内膜损伤。二、血流动力学改变:AVF建立后,回流静脉的血流量增大,吻合口远端内皮细胞受到的非生理性的高切应力,血流梯度不稳定,静脉侧的剪切应力相应增加。虽然在动静脉内瘘成熟过程中,随着血管的扩张和层流的重新建立,剪切应力的水平会逐渐下降,但吻合口静脉端内皮细胞(Endothelial cell,EC)却会受到持续的壁剪切应力作用;三、尿毒症状态:终末期肾病患者(End-stage renal disease,ESRD)体内毒素积聚,高磷、高钙、炎症、氧化应激及炎性因子增加,本身可导致机体多个器官系统和血管的改变。研究发现,血液透析患者血管EC功能障碍与血管内膜增生的发生早于AVF通路建立前。四、炎症:慢性持续的代谢性炎症是慢性肾脏疾病(Chronic Kidney Disease,CKD)的主要特征,而在微炎症环境下,多种炎症因子的分泌增加。在动物模型及临床研究中均发现AVF局部炎症细胞浸润,这些炎性细胞可以促进炎性介质的释放、细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)沉积及血栓形成,进而发展为动静脉内瘘失功。血管平滑肌细胞是动脉中膜重要的组成成分,具有表型可塑性的特点。平滑肌细胞的表型转化与增殖受多种信号通路的调节,在环境改变时,可由分化成熟的收缩表型重新去分化而成为合成表型,参与血管损伤的修复、新生血管的成形以及血管重构等。我们已发表的研究证实,血管平滑肌细胞表型转化和异常的增殖、迁移,引起血管新生内膜过度增生,是导致AVF狭窄、失功的病理基础。Notch信号通路进化上高度保守,在多个物种中具有同源结构,是细胞发育、分化、凋亡的调节器,是介导细胞间接触信号传导的主要机制之一,现已知哺乳动物中存在4种Notch受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)和5种配体(Jagged1、Jagged2、Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4)。Notch信号的活化是通过细胞间的接触使配体和Notch受体反式交互结合而实现的。Notch信号的活化需要通过三步蛋白酶切反应,最后以Notch受体胞内段(Notch Intracellular Domain,NICD)的活化形式被释放。既往的研究中,研究者大多是运用内皮细胞及平滑肌细胞体外共培养或向细胞培养液中添加可溶性的Jagged 1的方式,对Notch通路的活化进行研究。我们的前期研究及国外报道显示,Notch信号通路在平滑肌细胞的表型转化和增殖过程发挥重要作用,但Notch信号在AVF的内膜增生中的具体作用机制尚不明确。本研究首先通过免疫组化、免疫荧光技术发现AVF存在平滑肌细胞的表型转化和Notch信号活化;然后首次运用尿毒症患者血清,在体外培养平滑肌细胞和内皮细胞,运用ELISA、Western blot及QPCR技术,揭示尿毒症血清可上调血管平滑肌细胞Notch1及血管内皮细胞配体Jagged 1的表达,活化血管平滑肌细胞Notch信号通路,促进其表型由收缩型向合成型转变,促进血管平滑肌细胞移行功能及异常增殖,并对尿毒症血清促进AVF内膜增生的机制进行了初步探讨。研究目的:1.研究尿毒症血清对血管平滑肌细胞表型转化及功能的影响。2.探讨尿毒症血清对血管平滑肌细胞表型转化及动静脉内瘘狭窄与失功的作用机制。研究方法:1.(1)通过弹性纤维及免疫组化染色,比较正常血管及内瘘的内膜厚度,观察两者成纤维细胞特性蛋白-1(Fibroblast-specific protein-1,FSP-1)、增殖细胞核抗原(Proliferatin cell nuclear antigen,PCNA)的表达;并比较尿毒症患者术前及术后1周血管组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(Smooth muscle myosin heavy chain,SMMHC)表达的变化;(2)培养人原代主动脉平滑肌细胞株,依据血清及其在培养基所占比例,分为无血清组、正常血清组(10%)、5%、10%、15%、20%尿毒症血清组,培养24-48h,Western blot检测平滑肌细胞α-SMA、平滑肌22α(Smooth muscle 22α,SM22α)、FSP-1、PCNA蛋白的表达。QPCR检测无血清组、正常血清组、10%尿毒症血清组细胞SMMHC、SM22α、FSP-1、PCNA的mRNA表达水平。2.(1)通过免疫组化染色及免疫荧光比较正常血管及内瘘组织Notch胞内段(Notch intracellular domain,NICD)的表达。(2)Western blot检测无血清组、正常血清组(10%)、5%、10%、15%、20%尿毒症血清组平滑肌细胞NICD蛋白的表达。(3)QPCR检测无血清组、正常血清组、10%尿毒症血清组平滑肌细胞Hes1、Hes5、Notch1、Notch2、Notch3的mRNA表达水平。(4)使用Notch信号抑制剂(γ-secretase inhibitor,DAPT)预处理无血清组、正常血清组、10%尿毒症血清组平滑肌细胞,Western blot及QPCR分析比较SM22α、FSP-1蛋白和mRNA表达的变化,并与未经DAPT处理的平滑肌细胞相比较。同时比较Hes1 mRNA的表达。(5)划痕试验检测无血清组、正常血清组、10%尿毒症血清组平滑肌细胞的移行功能。3.(1)免疫组化染色检测正常血管及内瘘组织中Notch配体Jagged 1的表达。(2)Western blot检测无血清组、10%正常血清组、10%尿毒症血清组平滑肌细胞Jagged 1蛋白的表达。(3)ELISA检测无血清组、10%正常血清组、10%尿毒症血清组血管内皮细胞Jagged 1蛋白的表达。研究结果:一、尿毒症患者血清促进VSMC增殖及表型转化1.弹性纤维染色(Elastic-Van Gieson staining,EVG)显示,与正常血管组织相比,动静脉内瘘的血管壁内膜增厚明显;免疫组织化学染色发现,与术前相比,术后1周患者内瘘头静脉肌层内α-SMA、SMMHC的表达减少,且在AVF增生的内膜中,FSP-1和PCNA呈阳性表达的细胞较正常血管组织增加,差异有统计学意义(P<0.05)。提示AVF内膜增生可能与VSMC的增殖及表型转化相关。2.与正常血清组相比,10%尿毒症血清组平滑肌细胞α-SMA、SM22α蛋白的表达下降(P<0.05),FSP-1、PCNA蛋白表达增加(P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)上述蛋白的表达与尿毒症血清呈浓度依赖性。10%尿毒症血清组平滑肌细胞的SMMHC、SM22α的mRNA表达较正常血清组下降(P<0.05),而FSP-1、PCNA的mRNA表达较正常血清组增加(P<0.05)。提示,尿毒症血清可促进血管平滑肌细胞表型转化,细胞表型由收缩型向合成型转化。二、尿毒症血清活化Notch信号通路介导VSMC表型转化及移行功能1.NICD主要表达于AVF增生内膜细胞的核内,并且AVF增生的内膜中存在大量NICD/FSP-1双染阳性表达的细胞。提示内瘘增生内膜细胞中存在Notch的活化。2.与正常血清组相比,10%尿毒症血清组平滑肌细胞中NICD蛋白的表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),并与尿毒症血清呈浓度依赖性。3.与正常血清组比较,10%尿毒症血清组细胞Hes1、Hes5、Notch1、Notch3的mRNA表达增加(P<0.05),Notch2的表达无明显差异(P>0.05)。表明尿毒症血清可活化Notch信号通路,促进平滑肌细胞增生。4.经DAPT预处理后,平滑肌细胞SM22α蛋白及mRNA的表达上调(P<0.05),FSP-1蛋白、mRNA及Hes1 mRNA表达下调(P<0.05),提示,阻断血管平滑肌细胞Notch信号通路,可抑制尿毒症血清诱导的细胞表型转化及增殖。5.划痕实验结果发现:与正常血清组相比,10%尿毒症血清组平滑肌细胞的迁移率增加,差异有统计学意义(P<0.05)。此实验表明尿毒症血清可促进血管平滑肌细胞的移行。三、AVF及血管内皮细胞Jagged 1的表达1.免疫化染色显示:对照静脉内,仅见血管内皮细胞上有Jagged 1表达,内瘘组织Jagged 1的表达增加(P<0.05),主要位于增生内膜细胞中及血管内皮细胞胞膜上。提示尿毒症环境下,AVF内膜细胞内Jagged 1的表达上调。2.免疫蛋白印迹示:与正常血清组比较,10%尿毒症血清组HASMC的Jagged 1蛋白的表达增加(P<0.05)。3.ELISA检测示10%尿毒症血清刺激下,HUVEC表达Jagged 1蛋白较正常血清组显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论实验结果提示,尿毒症血清通过上调血管平滑肌细胞Notch1及血管内皮细胞配体Jagged 1的表达,活化血管平滑肌细胞Notch信号通路,促进其表型由收缩型向合成型转变,介导血管平滑肌细胞移行功能的增强及异常增殖,可能是尿毒症患者动静脉内瘘新生内膜增生的机制之一。