【摘 要】
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目的:本研究拟探索XCT/GPX4/GSH在肺炎链球菌菌体蛋白促进巨噬细胞炎症因子表达中的作用,丰富肺炎链球菌感染致病的分子机制并为治疗肺炎链球菌感染提供新的靶点。方法:1.利用转录组学筛选感染前后巨噬细胞差异表达基因（DEGs）;利用RT-q PCR技术检测感染前后巨噬细胞M1型极化标志物NOS2、CD86以及M2型极化标志物CD206、IL-10的转录水平;利用Western-blot检测细胞
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目的:本研究拟探索XCT/GPX4/GSH在肺炎链球菌菌体蛋白促进巨噬细胞炎症因子表达中的作用,丰富肺炎链球菌感染致病的分子机制并为治疗肺炎链球菌感染提供新的靶点。方法:1.利用转录组学筛选感染前后巨噬细胞差异表达基因（DEGs）;利用RT-q PCR技术检测感染前后巨噬细胞M1型极化标志物NOS2、CD86以及M2型极化标志物CD206、IL-10的转录水平;利用Western-blot检测细胞NLRP3炎症小体和NOS2水平,利用ELISA检测细胞培养上清炎症因子的水平。2.采用透射电子显微镜（TEM）技术观察感染后的巨噬细胞细胞器变化;利用Western-blot检测肺炎链球菌菌体蛋白感染的巨噬细胞抗氧化轴XCT/GPX4/GSH表达水平并检测活性氧（ROS）水平,通过添加抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）进行验证并检测细胞炎症变化情况。3.在动物实验中,小鼠鼻腔滴注2×10~7 CFU的肺炎链球菌构建肺部感染模型,通过肺组织切片HE染色和测定支气管-肺泡灌洗液（BALF）中炎症因子水平分析肺组织的炎症反应情况,利用Western-blot检测肺组织XCT和GPX4的表达水平。4.利用差异表达PLY的两种肺炎链球菌菌体蛋白分别处理巨噬细胞,以及使用PLY抗血清,利用Western-blot检测GPX4含量。5.分别利用重组表达的野生PLY和无溶血活性的PLY突变体处理巨噬细胞,检测巨噬细胞XCT/GPX4/GSH的蛋白表达水平和ROS生成水平。结果:1.利用转录组学分析共筛选到1615个DEGs,其中上调表达的基因926个,下调表达的基因689个,炎症相关的基因TNF、CD86、NOS2、IL-6等显著上调,GPX4、NRF2等抗氧化基因明显下调。巨噬细胞感染肺炎链球菌后M1型极化标志物NOS2的表达明显升高（P＜0.05）,伴有炎症小体NLRP3的激活和炎症因子的分泌。2.透射电镜下可见肺炎链球菌菌体蛋白感染后的巨噬细胞存在线粒体肿胀,嵴减少,染色质疏松等改变。感染的巨噬细胞其XCT、GPX4和GSH表达受到显著抑制,细胞内ROS水平升高,加入Fer-1处理细胞,其XCT和GPX4含量得以改善提高,炎症小体NLRP3水平和炎症因子含量降低。3.在小鼠感染模型中,鼻腔吸入感染肺炎链球菌的小鼠肺组织存在明显的充血和大量炎症细胞浸润,BALF中可检测到大量炎症因子,肺组织XCT和GPX4蛋白显著减少。4.相比N-乙酰氨基葡萄糖中生长的肺炎链球菌,葡萄糖中生长的细菌其毒力蛋白PLY水平更高,抑制GPX4表达效应更显著;同时加有细菌和PLY抗血清的巨噬细胞,GPX4含量得以改善。5.单纯用重组PLY蛋白刺激巨噬细胞,同样显著抑制XCT、GPX4以及GSH的表达,使ROS水平升高,这一效应呈剂量依赖性且与PLY溶血活性有关。结论:肺炎链球菌通过PLY蛋白抑制巨噬细胞XCT/GPX4/GSH轴激活炎症小体NLRP3和促进炎症因子的表达。
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