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疾病的预防与控制是现代养猪生产的关键问题,因而发掘疾病抵抗候选基因并应用于抗病育种的实践越来越重要。前期通过感染沙门氏菌猪肺脏的转录组研究我们筛选出许多差异表达基因,其中包括干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白(interferoninducible guanylate bindins proteins,GBPs)家族的GBP1和GBP2。研究表明,GBPs类似于Mx蛋白(myxovirus)都属于干扰素诱导的GTP酶大家族,他们对生物体抵抗细胞内病原微生物感染起着重要作用。因此,我们以猪的GBP1和GBP2基原因研究对象进行了基因克隆,染色体定位,亚细胞定位,与免疫性状的关联分析和感染实验等相关研究。主要的研究结果如下:
1.克隆了猪GBP1和GBP2基因3003bp和2237bp长的cDNA序列并分析了基因组结构,发现两个基因都包含11个外显子。推导的氨基酸序列分析显示这两个基因都包含经典的GTP结合基序,并且C末端具有蛋白质异戊二烯化修饰的CAAX基序。
2.利用体细胞和辐射杂种板将GBP1和GBP2分别定位于SSC4q21-q23和SSC4q24,都和SWR153标记紧密连锁。
3.RT-PCR方法分析组织表达发现GBP1和GBP2基因都在成年通城猪的脾脏具有很高的表达水平,转染融合表达质粒的亚细胞定位结果显示GBP1和GBP2均在细胞质中表达。GBP1和GBP2基因在RNA水平上有着十分相似的表达模式。Poly(I:C)刺激PK15细胞的实验显示两个基因在刺激6小时后开始上调,6小时到12小时表达量迅速增加,在约24小时后达到表达的顶峰,随后在24到48小时开始回落。克隆了两个基因5’调控区的序列,转录因子预测结果表明ISRE和GAS顺式作用元件可能在调控GBP1和GBP2基因表达中起关键作用。
4.在两个基因中分别发现T4个和3个SNP位点,并对其中两个改变氨基酸的SNP位点进行了免疫性状的关联分析,中外猪种的基因型频率分析。关联分析结果显示GBP1的Eco81I多态位点和GBP2的SspI多态位点均和17日龄的红细胞计数(RBC),血红蛋白浓度(HGB)和血细胞压积(HCT)显著相关。
5.G418稳定筛选并结合流式细胞分选技术建立了GBP1和GBP2基因的高表达PK15细胞株。
6.发现GBP1和GBP2的高表达都可对鼠伤寒沙门氏菌的增殖起抑制作用。