食物过敏主要通过肠道致敏,食物致敏原蛋白耐胃肠消化或消化后形成含抗原表位的片段是致敏肠道黏膜免疫的重要条件。食物在胃肠道消化时,蛋白质会被逐渐降解,形成大分子片段、小分子肽和氨基酸,在肠道被人体吸收利用。在此过程中,致敏原蛋白会在胃肠消化酶、胃酸等影响下发生结构变化,从而破坏原有的抗原表位或暴露隐藏的抗原表位。当含抗原表位的消化片段经肠道转运后,会引起机体过敏反应。鸡蛋作为致敏率高居第二的常见食物,蛋清中的卵转铁蛋白的致敏性被视为与卵类粘蛋白相似,也具有较强的致敏性。本课题组前期研究也提示,消化后的卵转铁蛋白可能具有较强的潜在致敏性。基于此,本论文继续开展卵转铁蛋白的模拟胃肠消化产物致敏性的评估,期望进一步理解卵转铁蛋白模拟消化产物在食物过敏重要阶段中的作用。本论文以鸡蛋蛋清中卵转铁蛋白为原料,对其分别进行体外模拟婴幼儿和成年人的胃液、小肠液及小肠刷状缘膜酶的消化,评估模拟婴幼儿、成年人消化产物片段与特异性抗体结合的能力;并采用Caco-2细胞单层膜模型测定卵转铁蛋白模拟消化产物在肠上皮细胞的转运能力,研究它们对肠上皮细胞紧密连接蛋白的影响;通过检测小鼠骨髓树突状细胞对卵转铁蛋白模拟消化产物的摄取率,评价其免疫刺激能力;利用BALB/c小鼠构建致敏模型,根据致敏小鼠临床症状、组织病理、血清中特异性抗体、脾细胞中细胞因子分泌、T细胞亚群分化多个生化指标,评估卵转铁蛋白模拟消化产物的致敏性;并结合肠道黏膜免疫系统肠系膜淋巴结中的树突状细胞和不同T细胞亚群的表达,评估卵转铁蛋白模拟消化产物对肠道黏膜免疫系统的影响,进一步阐明卵转铁蛋白经模拟胃肠体外消化产物的致敏机制。主要的研究方法、结果和结论如下:（1）采用弱阳离子交换层析和羟基磷灰石层析结合的方法,提取鸡蛋蛋清中卵转铁蛋白,经SDS-PAGE鉴定,其纯度达到95%以上;将分离纯化体系线性放大并优化,再经一个纯化周期可得到克级卵转铁蛋白,纯度仍高达95%以上。运用Tricine-SDS-PAGE表征卵转铁蛋白分别经体外模拟婴幼儿和成年人体系消化后的产物,发现模拟婴幼儿消化产物中仍有部分未被消化的卵转铁蛋白;而模拟成年人消化产物中则基本不存在未被消化的卵转铁蛋白,且消化产物中较大分子量的片段在数量上也少于模拟婴幼儿消化产物。采用免疫印迹法评估消化产物的潜在致敏性,结果表明模拟婴幼儿和成年人消化的产物中均含有可与特异性抗体Ig G结合的片段,具有一定的潜在致敏性,但模拟婴幼儿消化产物中可结合的片段更多,其潜在致敏性要强于模拟成年人消化产物。（2）实验构建了完整性良好的Caco-2细胞单层膜模型。卵转铁蛋白模拟消化产物都可在Caco-2细胞单层膜上被转运,且同一转运时间段内,转运率为卵转铁蛋白<模拟婴幼儿消化产物<模拟成年人消化产物。对转运后的Caco-2细胞单层膜进行紧密连接蛋白Occludin、ZO-1的免疫荧光实验,相比模拟成年人消化产物,模拟婴幼儿消化产物对该单层膜细胞间的紧密连接性破坏更严重。此外,实验提取了纯度高达88%的骨髓树突状细胞,将该细胞与荧光标记的卵转铁蛋白模拟消化产物共孵育,采用流式细胞仪检测各类荧光表达。结果显示,卵转铁蛋白被骨髓树突状细胞摄取的比率最低,模拟婴幼儿消化产物的被摄取率高于模拟成年人消化产物;但卵转铁蛋白模拟消化产物激发骨髓树突状细胞产生的表面共刺激分子CD40、CD86无显著影响,仅有模拟婴幼儿消化产物对树突状细胞表面功能因子CD103的表达具有显著上调作用。（3）建立了经口致敏的BALB/c小鼠模型,评估了卵转铁蛋白模拟消化产物的致敏性。从过敏症状、体温变化及空肠、肺部的病变四方面分析表明,卵转铁蛋白组小鼠致敏症状明显,而模拟消化产物组症状均较轻。通过间接ELISA实验测定血清中与Th2相关的特异性抗体水平（Ig E、Ig G和Ig G1）,相比模拟成年人消化产物,模拟婴幼儿消化产物更显著地上调了抗体水平。采用多重因子检测试剂盒检测脾脏细胞分泌的各类细胞因子,模拟婴幼儿消化产物较模拟成年人消化产物更促使脾脏细胞增加Th2型细胞因子的分泌、降低Th1型细胞因子的分泌。将脾脏细胞中T细胞不同亚群进行标记并经流式细胞术检测,结果表明模拟婴幼儿消化产物显著提高了Th2型细胞的表达,降低Th1型细胞的表达,模拟成年人消化产物次之。以上结果说明,卵转铁蛋白模拟消化产物可以促进机体免疫应答向Th2方向偏移,具有一定的致敏性,且致敏性强弱顺序为卵转铁蛋白>模拟婴幼儿消化产物>模拟成年人消化产物。（4）通过小鼠致敏模型,探究卵转铁蛋白模拟消化产物对肠道黏膜免疫系统的影响。采用流式细胞术分析肠系膜淋巴结中多种细胞的表达,结果表明,卵转铁蛋白及其模拟消化产物对小鼠肠道黏膜免疫系统MLN中CD11c+CD103+树突状细胞的表达和CD4+T细胞的表达均无显著影响,仅卵转铁蛋白对CD8+T细胞的表达有显著下调。但卵转铁蛋白及其模拟消化产物均可使MLN中Th1细胞显著下降,Th2细胞表达显著上升,且与空白组相比,模拟成年人消化产物上调MLN中Th2型细胞（P<0.001）、下调Th1型细胞（P<0.001）的程度更小。以上数据说明,卵转铁蛋白显著破坏肠道黏膜免疫系统的平衡,模拟婴幼儿消化产物次之。