论文部分内容阅读
目的:新疆维吾尔族妇女的宫颈癌发病率和死亡率较高,其早期发现是有效治疗的关键。为了筛选宫颈癌特异差异表达基因,建立肿瘤早期诊断指标,国内外学者开展了宫颈癌的转录组学研究,但是主要关注肿瘤特异上调表达基因,而关于下调表达基因的研究报道甚少。本课题拟在课题组前期宫颈癌的转录组学研究基础上,围绕下调表达候选基因的转录及启动子甲基化水平变化,探讨宫颈癌发病机制及早期预警指标。方法:1)收集维吾尔族妇女宫颈病变新鲜组织标本72例,其中宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)25 例、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)22 例和宫颈炎 25 例,提取组织总 RNA;选择 ABI3BP、FOS、KLF4、RHOB、ID4和IER2等6种候选基因,并设计mRNA序列特异性引物,对上述组织RNA进行候选基因转录水平的定量RT-PCR筛查分析;2)以前期研究为基础,选择12种宫颈癌特异下调表达候选基因,通过人类基因组数据库搜索,获得这些基因的基因组序列信息,并利用专业软件进行基因序列扫描,识别富含CpG序列的目的片段(CpG岛),设计出亚硫酸氢盐修饰测序引物(bisulfate-modified sequencing primer,BSP);利用亚硫酸氢盐修饰的SiHa宫颈癌细胞DNA和BSP方法,对每一基因的目的CpG片段进行PCR扩增、克隆和测序,研究所选基因的启动子甲基化水平;3)选择4例宫颈癌组织DNA,以4例宫颈炎组织DNA为对照,经亚硫酸氢盐修饰的组织DNA进行目的CpG片段扩增,选择每一例组织DNA(PCR产物)相应的10个克隆并测序,研究候选基因的肿瘤组织特异性甲基化水平变化。结果:1)通过定量RT-PCR分析,并与宫颈炎相比较,宫颈癌组织中候选基因ABI3BP、FOS、KLF4、RHOB、ID4和IER2的转录水平显著下降(P<0.05),而在CIN组织中,只有KLF4和FOS的表达水平下降,均有统计学意义(P<0.05);与CIN相比较,宫颈癌中ABI3BP、FOS、KLF4、ID4和IER2等5种候选基因的转录水平显著下降(P<0.05);2)利用专业软件(Methyl primer express,ABI)进行扫描分析,识别出 FOSB、EGR1、ISL1、CFD、FOS、KLF4、RHOB、ID4 和 IER2等9种基因的启动子区CpG岛片段,而在其余基因序列中,未能发现任何CpG岛;3)利用SiHa宫颈癌细胞DNA进行目的CpG片段的甲基化序列分析,发现ISL1和ID4基因的启动子发生甲基化,其中ISL1基因的33个CpG位点中,29个CpG位点发生甲基化,而在ID4基因的55个CpG位点中,47个CpG位点位点存在甲基化状态,但是其他基因的CpG片段中,均未发现甲基化的CpG位点;4)ISL1基因在宫颈癌组织DNA中高甲基化克隆比率为41.94%,而宫颈炎组织DNA为11.76%,进一步排除宫颈炎组织中发生甲基化的CpG位点,确定了宫颈癌组织特异性甲基化的 CpG 位点,主要为 CpG-4、CpG-5、CpG-8、CpG-11、CpG-21、CpG-26和CpG-27,但是在宫颈癌与正常对照组织中ID4基因的CpG片段均处于甲基化状态,并无任何差异。结论:1)宫颈癌发生发展与ABI3BP、FOS、KLF4、RHOB、ID4和IER2转录水平下调存在密切关系,其中KLF4和FOS的表达水平变化在癌前病变(CIN)与正常对照之间也存在显著差异,可能成为癌前病变诊断或宫颈癌早期预警的分子标志物;2)在宫颈癌特异下调表达基因中,ISL1基因的启动子CpG岛发生宫颈癌组织特异性甲基化,可能是一种宫颈癌发生的表观遗传学调控机制。