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目的:肝纤维化是是慢性肝病共同的病理基础。目前研究认为肝星状细胞（HSCs）活化是肝纤维化致病机制的中心环节。研究证实HSCs活化需要自噬参与,但自噬的调控机制并不完全清楚。已有研究发现多巴胺可能参与抑制肝癌生长,预实验结果发现多巴胺刺激HSCs内Ca2+浓度的增加,而Ca2+作为细胞内重要的第二信使可以调控包括细胞自噬在内的众多细胞生物学行为。瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）可调控细胞内外Ca2+稳态,可能是多巴胺诱导HSCs胞内钙离子水平改变过程中的关键钙通道。本研究旨在探讨多巴胺调控HSCs活化的潜在机制,为以神经递质和离子通道为靶点的抗肝纤维化的靶向治疗提供突破口。方法:1.使用CCK-8检测细胞增殖,检测多巴胺治疗前后,TGF-β1刺激LX-2、HSC-T6细胞增殖情况的变化。2.流式细胞技术检测细胞凋亡情况。检测多巴胺治疗前后,TGF-β1刺激LX-2、HSC-T6凋亡情况的变化。3.细胞水平使用Western-Blot技术检测,多巴胺治疗前后,TGF-β1诱导LX-2、HSC-T6活化前后α-SMA的蛋白表达变化及自噬相关蛋白P62、LC3蛋白表达变化。4.运用自噬双标腺病毒感染LX-2细胞,通过荧光显微镜观察比较多巴胺治疗前后,TGF-β1刺激LX-2细胞时自噬流的变化。5.动态高速钙离子成像系统检测不同浓度多巴胺刺激对LX-2、HSC-T6的胞内钙离子水平的影响。检测TRPV1是否参与了多巴胺诱导的HSCs的钙变化,比较抑制TRPV1功能前后,多巴胺刺激HSCs时的钙变化。6.Western-Blot检测激活TRPV1功能后,LX-2、HSC-T6细胞α-SMA及自噬相关蛋白LC3、p62的蛋白表达变化。7.自噬双标腺病毒感染LX-2后,观察激活TRPV1功能前后,TGF-β1对HSCs自噬流的影响。8.Western-Blot和自噬荧光检测加入SB-705498抑制TRPV1前后,多巴胺和TGF-β1共同作用对LX-2、HSC-T6细胞的α-SMA及自噬相关蛋白LC3、p62的蛋白表达变化。9.构建过表达或干扰TRPV1的质粒载体感染LX-2细胞,Western-Blot验证过表达和干扰是否成功,进一步检测过表达或干扰TRPV1前后,多巴胺和TGF-β1共同作用于HSCs后α-SMA表达的变化影响。10.使用Western-Blot检测验证多巴胺预刺激前后,TGF-β1诱导LX-2、HSC-T6细胞活化后磷酸化SMAD3蛋白的变化;检测SB-705498抑制TRPV1功能前后,多巴胺和TGF-β1共同作用于LX-2、HSC-T6后磷酸化SMAD3蛋白的变化。11.临床标本使用HE染色,Masson染色验证肝纤维化程度,免疫组织化学技术验证TRPV1的表达和自噬相关蛋白表达及肝纤维化指标的表达变化。12.采用CCl4灌胃诱导构建小鼠肝纤维化模型,从体内实验证明多巴胺治疗减轻小鼠肝脏的纤维化程度、降低肝脏组织自噬基因的蛋白表达。结果:1.使用CCK-8进行HSCs增殖情况的检测,显示TGF-β1可以促进HSCs的增殖能力,结果具有统计意义（p<0.05）,加入多巴胺后,可以显著抑制TGF-β1诱导的HSCs细胞增殖,结果具有统计意义（p<0.05）。2.凋亡实验检测多巴胺治疗前后,TGF-β1对HSCs凋亡的影响没有变化（p>0.05）。3.Western-Blot显示TGF-β1可以诱导HSCs细胞α-SMA、自噬蛋白LC3表达增加,自噬底物p62的表达降低,且具有统计意义（p<0.05）;加入多巴胺后,TGF-β1诱导的相关蛋白改变被显著逆转,提示多巴胺可逆转HSCs的活化和自噬发生,差异具有统计学意义（p<0.05）。4.自噬双标腺病毒感染LX-2细胞后,荧光显微镜结果显示TGF-β1可以诱导HSCs的自噬流增加,而多巴胺预刺激后,则有效抑制了TGF-β1诱导的HSCs的自噬流增加。5.（1）在2 m M外Ca2+环境下,多巴胺刺激HSCs胞内Ca2+上升,且多巴胺刺激呈浓度依赖性变化,结果具有统计学意义（p<0.05）。（2）在0 m M Ca2+环境下,多巴胺刺激未引起细胞内Ca2+浓度的变化。（3）在给予钙池依赖性钙通道阻断剂2-APB、钠钙交换器亚型1抑制剂KB-R7943作用HSCs细胞后,多巴胺刺激诱导的细胞内Ca2+浓度无变化。（4）给予TRP家族非特异性抑制剂SKF-69365后能显著抑制多巴胺诱导的HSCs内Ca2+浓度增高（p<0.05）。加入TRPV4抑制剂RN-1734后,多巴胺仍能刺激HSCs钙变化,但加入TRPV1抑制剂SB-705498后则明显抑制了多巴胺刺激的细胞钙增加。（5）TRPV1激动剂capsaicin可刺激HSCs的钙变化（p<0.05）。6.Western-Blot显示TRPV1激动剂capsaicin刺激HSCs后,可以抑制α-SMA和自噬LC3蛋白的增加,抑制P62的降低。结果具有统计意义（p<0.05）。7.自噬双标腺病毒感染LX-2细胞,荧光显微镜观察到TRPV1激动剂capsaicin预刺激后,可以抑制TGF-β1诱导增加的HSCs的自噬流。8.Western-Blot显示多巴胺与TGF-β1共刺激抑制了α-SMA、自噬蛋白LC3表达的上升,给予TRPV1抑制剂SB-705498后,该作用消失。9.自噬双标腺病毒感染LX-2细胞,多巴胺抑制了TGF-β1诱导增加的自噬流,抑制TRPV1功能后,多巴胺对自噬流的抑制作用消失。10.使用质粒感染LX-2细胞干扰和过表达TRPV1后,Western-Blot验证TRPV1干扰过表达成功,结果具有统计学意义（p<0.05）。（1）Western-Blot检测显示与空转组相比,TRPV1过表达后,促进了多巴胺下调α-SMA的作用。（2）TRPV1干扰后,多巴胺不能下调α-SMA的表达（p<0.05）。11.（1）Western-Blot检测证实TGF-β1诱导活化HSCs后,磷酸化的SMAD3表达明显上升,结果具有统计意义（p<0.05）;加入多巴胺后,明显抑制TGF-β1诱导的磷酸化SMAD3的增加,结果具有统计学意义（p<0.05）。（2）而给予TRPV1特异性抑制剂SB-705498后,多巴胺不能下调TGF-β1诱导增加的磷酸化SMAD3的表达,且具有统计学意义（p<0.05）。12.HE染色、Masson染色观察比较临床肝组织样本的胶原沉积状态,将肝组织切片依据病理结果,分成正常组和肝纤维化组。与正常肝组织相比,肝纤维化组自噬蛋白LC3、肝纤维化指标α-SMA的表达增高,TRPV1表达下降,且具有统计学意义（p<0.05）。13.小鼠肝纤维化模型建立成功,HE染色和Masson染色观察显示,与正常组相比,模型组肝纤维化严重程度及肝损害明显,而多巴胺治疗组明显改善了肝纤维化的严重程度。使用Western-Blot技术检测各组TRPV1、α-SMA、P62的表达,与正常组相比,模型组的α-SMA表达增高、P62和TRPV1下降,而治疗组的α-SMA表达明显降低、P62和TRPV1表达回升,结果具有统计学意义（p<0.05）。结论:多巴胺刺激后,TRPV1通道被激活,并介导细胞内钙活化,细胞内钙信号重构,抑制HSCs细胞发生自噬,进而抑制TGFβ/SMAD3通道介导的HSCs的活化。提示多巴胺及TRPV1可能作为治疗肝纤维化的重要药物靶点。