论文部分内容阅读
柑橘是一种重要的经济作物,在约140个国家有种植,它既可作为鲜果直接食用,又可加工成果汁、罐头和蜜饯等产品。在长期栽培过程中,柑橘容易感染1种或多种病毒,并且传播扩散方式多样(嫁接、媒介和农事操作等),严重威胁柑橘产业的健康发展,尤其自2000年我国加入世界贸易组织后,外来病毒传入风险加大,对我国柑橘产业健康发展带来了潜在威胁。为了预防外来危险性病毒病害在我国柑橘产区的发生和扩散,我们在前期工作中对巴基斯坦田间的柑橘病毒种类进行了检测,其中有6份柑橘样品的常见柑橘病毒反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription ploymerase chain reaction,RT-PCR)检测结果为阴性,但嫁接至西蒙斯甜橙(Citrus sinensis)后能引起寄主叶片表现黄化斑驳症状。我们应用转录组测序(Transcriptiome sequencing,RNA-seq)和BLAST分析从这些样品中鉴定到一种新病毒,并从分子生物学、生物学、病毒粒子超微结构和血清学关系等角度进行研究,明确了该新病毒的分类地位。最后建立了该新病毒的实时荧光检测体系。本文的主要研究结果如下:1.发现一种侵染柑橘的印度柑橘病毒属(Mandarivirus)新病毒—柑橘黄化斑驳相关病毒(Citrus yellow mottle-associated virus,CiYMaV)。本研究针对120份从巴基斯坦采集的柑橘样品进行常见柑橘病毒的RT-PCR检测,其中包括柑橘囊胶相关病毒(Citrus concave gum-associated virus,CCGaV)、柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)、柑橘鳞皮病毒(Citrus psorosis virus,CPsV)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)、柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)、柑橘病毒A(Citrus virus A,CiVA)和温州蜜柑矮缩病毒(Satsuma dwarf virus,SDV)。结果表明8种柑橘病毒中仅CTV和CYVCV被检测出来,并且在检测结果为阴性的10个样品中,有6个样品(PCV31、PCV49、PCV59、PCV62、PCV64、PCV82)在寄主叶片上表现黄化斑驳症状。然后,提取这些样品的总RNA建立6个cDNA文库(PCV1-43、PCV44-93、PCV94-103、PCV104-112、PCV113-120、PCV31)分别进行RNA-seq。数据分析表明,在这6个转录组数据库中仅比对到3种植物病毒,除CYVCV和CTV外,还存在一种与Mandarivirus属病毒同源性最高的未知病毒。最后,利用RT-PCR技术和cDNA末端扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增获得CiYMaV的全基因组序列。2.分析CiYMaV的基因组结构、蛋白质功能以及系统进化关系等分子生物学特性。CiYMaV是一个正单链RNA病毒,由7 479个核苷酸组成,包含6个开放阅读框(Open reading frame,ORF),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Replication-associated polyproteins,REP),ORF2、ORF3、ORF4部分重叠组成三基因连锁模块(Triple gene block),编码病毒运动相关蛋白,ORF5编码病毒的外壳蛋白(Coat protein,CP),ORF6与ORF5部分重叠编码细胞核酸结合蛋白(Nucleic-acid-binding protein)。ORF1-ORF6与Mandarivirus属病毒具有最高序列相似性,在氨基酸水平上相似性分别为82.73%,63.72%,68.47%,78.69%,75.15%,78.48%,在核苷酸水平上相似性分别为73.31%,64.16%,71.21%,73.22%,72.90%,80.87%。基于同甲型线形病毒科及乙型线形病毒科代表种的CP、REP氨基酸序列和全基因组序列的系统进化分析,CiYMaV与Mandarivirus属病毒(CYVCV和ICRSV)聚在一个大分支内。这些结果表明,CiYMaV为Mandarivirus属的新病毒。3.明确CiYMaV与CYVCV在血清学、病毒粒子形态学和生物学上的关系。CiYMaV与CYVCV既具有相似性,又存在明显区别,1.相似性:1)病毒粒子均为长线形,2)CiYMaV对CYVCV的单克隆抗体1E1存在血清学反应;2.区别:1)CYVCV在尤力克柠檬(C.limon)和代代酸橙(C.aurantium)上引起严重的脉明和叶片卷曲症状,而CiYMaV在这两种寄主上不引起症状;CYVCV在西蒙斯甜橙上不引起明显症状,而CiYMaV在该寄主上引起黄化斑驳症状,2)CiYMaV对CYVCV的单克隆抗体26A1没有血清学反应。这些结果进一步支撑了CiYMaV是Mandarivirus属新病毒的结论。4.建立和应用CiYMaV的实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)检测体系。本研究通过引物筛选、引物浓度及退火温度等条件的优化,建立了CiYMaV的qRCR检测体系。经验证,该体系具有的特异性强,灵敏度较高(为常规RT-PCR的10倍),重复性好。应用该体系对来自云南地区采集的200份柑橘样品进行检测,暂未检测出CiYMaV。