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柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是柑橘产业的头号杀手,广泛分布于亚洲、非洲和美洲,且中国11个省（自治区）的300余个县遭受HLB的为害。迄今该病尚无药可治,对柑橘产业已构成严重威胁。其病原系柑橘韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter spp.）,其中亚洲柑橘韧皮部杆菌（C.Liberibacter asiaticus,CLas）的侵染性最强,为革兰氏阴性菌,田间主要经亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）传播。目前柑橘黄龙病菌纯培养这一世界性难题尚未攻克,对其理化性状的深入研究及病害治理技术的研发存在巨大挑战。自病原菌的全基因组序列2009年公布后,分析表明该病菌具有完整的Sec系统和分泌能力,而分泌蛋白在病原菌致病过程中发挥重要作用,但黄龙病菌分泌蛋白与寄主植物的互作研究还处于初级阶段。制备抗体用于探究病原物与寄主植物的互作是一种较为常用的手段。因此,本研究筛选了CLas的2个分泌蛋白基因,进行原核表达并制备抗血清,为研究这两个分泌蛋白基因功能奠定前期基础,也为建立HLB的血清学监测分泌蛋白田间表达动态及探究柑橘黄龙病菌分泌蛋白基因的筛选方法提供参考。所获得的主要研究结果如下:1、柑橘黄龙病菌分泌蛋白基因的筛选在Prasad等预测的166个分泌蛋白基因基础上,设定以下三个条件:1)均可用Phbius、SigP4.1、LipoP、SigP3.0分析,2)PhoA验证基因的SP具有分泌性功能,3)蛋白大小在10 kDa和25 kDa之间。初步筛选出7个分泌蛋白基因。通过逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测感病柑橘中潜在CLas分泌蛋白的表达,仅扩增出S9（CLIBASIA05150）和S10（CLIBASIA04040）分泌蛋白基因。通过在NCBI中blast比对,S9在CLas中高度保守,S10与亚洲种株系A4的相似性为100%,与其他4个亚洲种株系存在1个碱基差异,氨基酸序列比对结果发现第135个氨基酸存在差异,通过InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）在线预测出该氨基酸序列可能存在5个结构域,其中4个结构域不包含此差异位点。因此以分泌蛋白S9、S10作为研究对象。2、分泌蛋白S9和S10的原核表达及蛋白纯化依据NCBI中CLas-psy62的S9、S10核酸序列设计特异性引物,以江西10月份感病柑橘的DNA为模板进行PCR扩增,获得与之对应大小一致的特异性条带。并与表达载体pET-28a连接,重组表达载体pET-28a-S9、pET-28a-S10构建成功。转化大肠杆菌DH5α,通过双酶切和测序验证表明,克隆序列与对应CLas-psy62中的CLIBASIA05150、CLIBASIA04040序列相似度为100%,为目标序列,且编码框方向正确、碱基无移位。将重组表达载体pET-28a-S9、pET-28a-S10转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达后通过Western blot验证表明2个表达菌株表达目的蛋白成功。对诱导表达条件进行优化,2个表达菌株的最适诱导温度均为18℃,最适IPTG诱导浓度均为0.1 m M。S9仅存在于混液中,表明融合蛋白S9不可溶,以包涵体形式存在,S10同时存在于混液和上清中,表明融合蛋白S10为可溶蛋白。通过Ni2+-NTA亲和层析方法对融合蛋白S10进行纯化,S10在pH 8.0条件下的磷酸盐缓冲液中纯化效果更佳,目的蛋白主要在30-50 mM洗脱缓冲液中,无其他杂蛋白。Western blot验证表明纯化后获得的S10是目的蛋白。3、抗血清的制备及其效价分析纯化后的融合蛋白注射兔子体内进行免疫并制备抗体,获得S9和S10抗血清。S9抗血清的ELISA效价为1:4000,灵敏度可达1:32000,通过dot ELISA检测,S9抗血清可与田间样品发生显色反应,主要是9月份的样品,其阳性率占比PCR检测为阳性的38.9%,通过Western blot检测,S9抗血清可与融合蛋白S9杂交出特异性条带,但无法与田间感病样品发生阳性反应。pET-28a-S10抗血清的ELISA效价为1:4000,灵敏度可达1:512000,通过dot ELISA检测,S10抗血清也可与田间样品发生显色反应,主要是9月份的样品,其阳性率占比PCR检测为阳性的33.3%,通过Western blot检测,S10抗血清仅可与融合蛋白S10杂交出特异性条带。由此侧面印证分泌蛋白S9、S10与CLas关联,但仍需要更大田间样本量来加以证实,也需再优化检测方法的试验条件,建立更有效的检测手段。