百合多糖分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xinshuai99
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近年来,百合多糖因其特有的抗氧化、免疫调节、抗肿瘤及降血糖等活性而引起研究者关注。目前,对百合多糖的研究大多集中在粗多糖上,而对其进行分离纯化、结构鉴定及生物活性深入系统的研究报道还很少。宜兴百合(Lilium lancifolium Thunb.)是我国三大食用百合中药用价值最高的品种。本研究以宜兴百合鳞茎为原料,研究其多糖的分离纯化、基本理化性质、化学结构及体外抗氧化、免疫调节活性。主要结果如下:1、超声波辅助水提醇沉法获得百合粗多糖,得率为9.46%。用DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱、Sephadex G-100层析柱相继对粗多糖进行分离和纯化,得到3个组分LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3,得率分别是1.66%、1.71%和0.28%。高效液相凝胶过滤色谱法证明LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3都是相对均一的多糖组分,具有较高的纯度,其相对分子量分别为350.51 kDa、403.29 kDa和146.18 kDa。2、采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、硫酸-咔唑法和氯化钡-明胶法分别测定粗多糖和纯化组分LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3中的总糖、蛋白质、糖醛酸及硫酸基含量。结果表明:粗多糖中的总糖含量为78.01%、LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3中的总糖分别为97.40%、96.19%和79.69%;粗多糖中蛋白质含量是3.61%,而纯化百合多糖中不舍蛋白质;糖醛酸含量分别是6.33%、14.83%、12.19%和37.34%;硫酸基含量分别是1.34%、0.55%、0.43%和0.65%。LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3中不含有淀粉及酚类物质。3、多糖结构分析:(1)元素分析结果表明:百合多糖纯化组分的组成元素主要是C、H元素和微量的S元素,不合N元素。(2)高效阴离子交换色谱法分析LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3中单糖的种类及比例,结果为:LLPS-1多糖主链主要由葡萄糖和甘露糖按约2:1的摩尔比组成,含有微量的阿拉伯糖(每隔约42个糖单元有一个阿拉伯糖),可能含有极微量的岩藻糖和半乳糖。LLPS-2多糖主链主要由葡萄糖和甘露糖按1:1的摩尔比组成,可能含有微量的阿拉伯糖(每隔约53个糖单元有一个阿拉伯糖)。LLPS-3多糖主链主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖按约2:2:2:1的摩尔比组成,含有微量的半乳糖醛酸(即每隔约34个糖单元有一个半乳糖醛酸)。(3)红外光谱及核磁共振分析表明:LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3的糖环形式均为吡喃糖环;LLPS-1和LLPS-2的糖苷键均为β型,LLPS-3的糖苷键构型既有α型又有β型,以α型为主。研究结果还证明LLPS-1和LLPS-2中存在β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖;LLPS-3组分中存在D-葡萄糖、α-D-甘露糖、α-D-半乳糖和鼠李糖。(4)高碘酸氧化及Smith降解结果表明:LLPS-1.LLPS-2两个组分中糖苷键连接方式是以1→4键型为主,含有少量1→2或1→6键型,葡萄糖和甘露糖存在不被高碘酸氧化的1→3键型。LLPS-3中甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖以1→3键型为主,还含有1→4、1→2或1→6键型。(5)X-衍射分析表明:LLPS-1、LLPS-2和LLPS-3整个样品呈近似无定形状态,其中含结晶性的多糖或多糖复合物极少,结晶度非常低,只包含微量的晶体结构。4、采用化学方法研究百合多糖体外抗氧化活性,结果表明,粗多糖、LLPS-1和LLPS-2有较强的清除OH·自由基能力,适度的清除H2O2能力和较弱的还原力及清除O2·自由基能力。在一定浓度范围内,抗氧化活性随着多糖浓度增大而增强。总的来说,抗氧化活性强弱的顺序为:粗多糖>LLPS-2>LLPS-1.5、采用体外巨噬细胞RAW 264.7模型研究百合多糖体外免疫调节活性,结果表明,在25~400 μg/mL范围内,LLPS-1和LLPS-3对巨噬细胞增殖活性影响是随着浓度增加先升高后降低,100μg/mL达到最大值;LLPS-2则是增殖活性一直升高,在400μg/mL时和阳性对照LPS无显著差异(p>0.05)。3种纯化组分随浓度增加,刺激小鼠巨噬细胞吞噬中性红的能力先增强后略微减弱,在50~400μg/mL浓度范围内极显著高于空白对照(p<0.01)。3种纯化组分对NO释放的影响是随着浓度增加,释放的NO浓度逐渐升高,其活性呈一定剂量依赖性,在很低浓度(25 μg/mL)就能极显著促进巨噬细胞释放NO,在400μg/mL时极显著高于空白对照和阳性对照(p<0.01)。总的来说,体外免疫调节活性强弱的顺序是:LLPS-2>LLPS-3>LLPS-1。
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