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寨卡病毒(ZIKA Virus,ZIKV)是一种主要通过伊蚊传播的RNA病毒,属于黄病毒科黄病毒属中的成员。该病毒于1947年首次分离于乌干达地区的寨卡森林。ZIKV大多数感染者表现为无症状或仅有轻微症状,孕妇感染ZIKV可以将病毒传播给胎儿,致使新生儿患有先天性严重小头畸形和神经系统缺陷,同时还可以引起早产或流产。成年人感染ZIKV会引起一种罕见的严重自身免疫性疾病-格林-巴利综合征。在第一次有记载的太平洋岛发生人感染ZIKV案例和近期南美ZIKV流行性感染暴发并迅速传播至全球60多个国家之前,该病毒并未受到关注。最近在中美洲和南美洲爆发的疫情引起了公众对ZIKV感染的广泛关注,对ZIKV的研究也有一些新的进展。然而,ZIKV与宿主细胞互作的机制尚未确定,针对ZIKV的疫苗或治疗ZIKV感染的药物尚未研制成功。在本实验室对KPNA6和ZIKV互作机制的研究中发现,ZIKV感染宿主细胞可以引起核转运蛋白KPNA6的表达升高,KPNA6基因敲除可以抑制ZIKV的复制。在应用蛋白质质谱分析未感染和ZIKV感染样品的实验中,筛选出ZIKV感染后降低的多个蛋白,其中,KPNA2在ZIKV感染后显著性降低。Karyopherinα2(KPNA2,也称为importin-α1)是一些转录因子的主要传输蛋白,以激活细胞的增殖和分化,在多种癌症相关的研究中均发现了KPNA2表达水平的异常。本研究分为以下四个部分。首先,为确定寨卡病毒对核输入蛋白KPNA2的影响,检测了ZIKV感染后KPNA2蛋白水平和m RNA水平,发现ZIKV感染后KPNA2的蛋白水平显著降低,但m RNA水平没有显著变化,且KPNA2蛋白水平的降低与时间和感染复数呈正相关。检测不同细胞系感染ZIKV后KPNA2的水平变化发现,ZIKV可引起Vero、Hela和SK-N-SH细胞内KPNA2的降低。第二,为解析核输入蛋白KPNA2降解的途径,通过蛋白酶抑制剂MG132和水解酶抑制剂NH4CL对细胞的处理后发现,这两种抑制剂都能使由于ZIKV感染降低的KPNA2的水平得到恢复。对ZIKV感染后KPNA2半衰期进行检测发现,ZIKV感染可引起KPNA2半衰期的缩短,促进KPNA2的降解。对细胞内泛素化水平检测后发现,ZIKV感染并没有引起细胞内泛素化水平的显著变化。由此推测KPNA2主要通过溶酶体途径降解。分析KPNA2的序列后发现其含有伴侣分子介导的自噬通路(Chaperone mediated Autophagy,CMA)底物的特征-KFERQ样基序。对KPNA2与CMA通路中的溶酶体相关膜蛋白2A(Lysosome membrane-associated protein type 2A,LAMP2A)相互作用的研究确定了KPNA2与LAMP2A存在相互作用。LAMP2A敲降可以使KPNA2的水平升高,并且可以恢复由于ZIKV感染导致的KPNA2的降低。第三,为阐述寨卡病毒对KPNA2降解作用的机制,对寨卡病毒的蛋白进行了筛选,确定出ZIKV非结构蛋白NS2A是导致KPNA2降低的关键蛋白。在KPNA2和NS2A相互作用的研究中发现,NS2A和KPNA2存在相互作用。但在LAMP2A敲降的细胞中,NS2A的表达不再引起KPNA2的降低。为筛选引起KPNA2降低的关键位点,构建了NS2A截短突变体,发现NS2A-D1和NS2A-D2都可以引起KPNA2降低,对它们共有的第90-100位氨基酸进行点突变,构建了NS2A突变体,发现第100位突变体NS2A-M4可以使KPNA2的水平得到恢复。对NS2A-M4和KPNA2之间相互作用的研究发现,NS2A-M4几乎丧失了与KPNA2之间的相互作用。为揭示NS2A对ZIKV复制的影响,利用反向遗传学技术拯救了突变株病毒,发现第100位氨基酸突变的病毒株复制能力显著降低,且突变株病毒的感染不再引起KPNA2蛋白水平的显著变化。第四,为研究核转运蛋白KPNA2对寨卡病毒复制的影响,对KPNA2序列中的KFERQ样基序LSREKQ进行了功能失活型突变,发现第109位氨基酸突变体KPNA2-M4不再引起KPNA2的降低,推测第109位氨基酸对CMA途径有重要意义,对KPNA2-M4与细胞内LAMP2A相互作用的研究发现,KPNA2-M4与LAMP2A的结合能力显著下降。另外,KPNA2敲降的细胞中ZIKV的复制能力显著升高,揭示了KPNA2潜在的抗病毒作用。本研究应用分子生物学、细胞生物学、病毒学、突变PCR、反向遗传学等技术方法对ZIKV和宿主细胞核输入蛋白KPNA2的互作机制进行了研究,阐明了核输入蛋白KPNA2通过溶酶体内伴侣分子介导的自噬途径降解,寨卡病毒感染促进KPNA2的降解;通过定点突变,明确了KPNA2第109位氨基酸是其被伴侣分子介导的自噬途径降解的关键位点;确定了ZIKV NS2A通过CMA途径使KPNA2降解,NS2A第100位氨基酸是寨卡病毒导致KPNA2降低的关键位点;发现了NS2A T100A突变可以抑制寨卡病毒的复制。另外,KPNA2敲降引起寨卡病毒复制增强,这表明KPNA2介导某些抗病毒作用。本研究为深入阐明寨卡病毒的复制及致病机理奠定了基础,为针对寨卡病毒的疫苗和靶向药物的开发提供了理论依据。