论文部分内容阅读
第一部分氯化镉对非洲爪蟾卵母细胞上表达的大鼠P2X4受体介导的ATP-激活电流的调制作用第一部分目的:研究氯化镉对大鼠P2X4受体功能的调制作用及其机制。方法:运用体外转录cRNA技术,将克隆至真核表达载体pcDNA3的P2X4的cDNA转录成P2X4的cRNA,再通过显微注射技术将该cRNA注入去滤泡膜的成熟非洲爪蟾卵母细胞的胞质中进行表达。应用双微电极电压钳记录表达在非洲爪蟾卵母细胞上的P2X4受体介导的ATP激活电流(IATP)及镉对电流的调制作用。结果:（1）P2X4受体在非洲爪蟾卵母细胞上成功表达,在同一钳制电位下,记录到的电流幅度随着ATP浓度的增加电流(IATP)幅值增大（。2）用浓度为100μmol/L的PPADS、Suramin灌流不能改变IATP幅值。（3）在一定范围内,镉能增强表达在爪蟾卵母细胞的P2X4受体激活电流。最大作用量是30微摩尔,当超过30微摩尔时,随着镉浓度的升高,作用电流反而减弱,提示高浓度的镉可能干扰了可以引起抑制变构效应的部位。（4）镉引起ATP量效曲线左侧移位。应用10微摩尔的镉加ATP同时灌流细胞,可以使ATP EC50减半,降低它的值从17.1±1.7（n=4）到10.1±1.7微摩尔（n=4,P<0.01）。提示镉可以增强ATP电流,并且镉所引起的ATP激活电流的最大效应不变,而EC50减半。（5）在不同的钳制电压下,镉的这种电流增强作用并没有显示出对钳制电压的依赖性,也并不改变IATP的翻转电位;（6）卵母细胞在用10μmol/L镉预孵育20s,60s,120s,180s, 300s的情况下灌流,结果显示达到它的最大增强幅值只需要60秒。结论:镉能增强表达在非洲爪蟾卵母细胞上的P2X4受体介导的ATP-激活电流(IATP),这种调制作用是一种变构作用。镉在一定的浓度范围内（低于30μM）呈现浓度依赖性,当超过此最大量时,随着镉浓度的升高,作用电流反而减弱,推测高浓度的镉可能正好与抑制变构效应的部位相互影响。第二部分卵母细胞对温度变化刺激诱导的电流反应及其机制目的:研究爪蟾卵母细胞对温度变化刺激诱导的电流反应及其机制。方法:手术取卵叶,分离单个卵母细胞,实验采用双电极电压钳技术。选取静息膜电位大于-30mV的卵母细胞进行实验,钳制电压为-50mV,实验过程中,用15℃左右Ringer’s液持续灌流（2ml/min）的细胞为对照,用不同温度Ringer’s液灌流细胞,记录卵母细胞的膜电流。结果:1.用0℃～5℃Ringer’s液灌流细胞,迅速产生一快内向电流,有的细胞还出现慢内向电流和慢外向电流。快内向电流幅度为-400±23nA（n=6）。翻转电位为-20mV,随灌流次数增加,快内向电流幅度依次减小,到第十次灌流时,快内向电流仅为初次灌流时幅度的百分之5。最后变得对低温Ringer’s液灌流不敏感,从敏感到失敏大约2h～5h不等。2.用35℃Ringer’s液灌流时,可记录到单一的内向电流反应,幅值为-56±12nA（n=6）,每隔8分钟灌流一次,随着灌流次数的增加,内向电流幅度不表现衰减现象。分别用25℃、30℃和35℃三种温度的Ringer’s液灌流细胞,随着温度的增加,电流幅度明显增大。3.改变钳制电压,电流幅度随之改变,用0～5℃Ringer’s液灌流,翻转电位为-20mV左右,用氯化胆碱取代灌流液中的氯化钠进行灌流,电流幅度并没有明显影响（P>0.05）。当用35℃Ringer’s液灌流细胞时,翻转电位为-10mV左右。结论:以上结果表明:温度的突然变化可以引起卵母细胞膜电流反应并显示出膜通道的特性,可以引起跨膜离子流动,推测低温和高温刺激所诱发的膜电流可能是由不同的离子活动所引起的。