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研究背景与目的:糖尿病肾病(DN)是糖尿病的慢性并发症,糖尿病肾病的发病机制至今未完全阐明。蛋白尿是糖尿病肾病的主要临床表现,也是引起肾脏损伤的独立危险因素,蛋白尿的发生与肾小球滤过屏障有关。由足细胞及其相关分子构成的肾小球滤过屏障的结构和功能障碍在DN蛋白尿的形成中起着重要作用,是近来的研究热点。本研究建立糖尿病大鼠模型,从不同时间点动态观察肾小球足细胞数量和密度的变化、足细胞相关分子nephrin、WT1、PCX在肾组织中的表达以及nephrin在尿中的排泄,探讨足细胞及相关分子在DN蛋白尿发生发展中的改变及意义。同时应用氯沙坦对不同时期DN给药进行干预,了解其对足细胞及相关分子的影响,探讨氯沙坦降低尿蛋白、保护肾功能的机理,为DN的发病机制、诊断和防治提供理论依据。方法:采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型,将糖尿病模型大鼠随机分为糖尿病非干预组(DM组)、早期氯沙坦干预组(DL1组,实验初予氯沙坦30mg/kg·d)、中期氯沙坦干预组(DL2组,实验开始4W后予氯沙坦30mg/kg·d),以正常大鼠作对照组(NC组)。NC组及DM组分别于2、4、6、8、12周测尿白蛋白(UA),血糖(BG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr),计算血清肌酐清除率(Ccr),取肾组织行常规病理检查,免疫组化、Western-Blot分析技术检测肾脏nephrin、WT1、PCX的表达,Westem-Blot分析技术检测nephrin在尿中排泄。DL1、DL2组于实验末(12W)收集标本,观察指标同DM组。结果:1.与NC组相比,DM组和DL1、DL2组的BG明显升高(P＜0.01),DM组和DL1、DL2组的BG水平无统计学差异(P＞0.05)。2.DM组尿白蛋白(mg/L)排泄逐渐增多,2W与对照组比较无统计学差异(P＞0.05),4W高达72.21±8.24,显著高于对照组6.87±0.67(P＜0.05),直至12W,表明糖尿病大鼠成模4W后出现糖尿病肾病。DM组BUN(mmol/l)渐增高,2W与对照组比较无统计学差异,4W达10.24±0.46,明显高于对照组5.34±0.23(P＜0.05),直至12W。DM组Ccr(ml/min·Kg)渐下降,6W达3.27+0.26,与对照组(6.78±0.37)比较有统计学差异(P＜0.05),糖尿病肾病白蛋白尿早于BUN、Ccr异常的出现。DL1组、DL2组尿白蛋白分别为98.54±22.37、112.76±21.74,低于同期DM组211.35±18.23(均P＜0.05);BUN分别为12.27±1.64、13.09±1.58,低于同期DM组15.33±1.76(均P＜0.05);Ccr分别为3.26±0.68、2.764±0.74较同期DM组1.934±0.37升高(P＜0.05),但DL1与DL2组间比较无统计学差异(P＞0.05)。3.DM组2W开始出现肾小球足细胞密度(WT1阳性细胞面积/肾小球面积%)降低(17.64±0.93):与NC组(29.4±1.21)比较,P＜0.05。肾小球足细胞计数(个/1000um~2肾小球)于4W出现明显下降,与NC组相比差异有显著性[(13.64±2.04)比(18.2±2.13),P＜0.05]。免疫组化分析各指标的阳性区平均积分光密度及Western-Blot分析各指标的吸光度值,结果显示:与NC组相比,DM组足细胞相关分子nephrin、WT1、PCX蛋白均于2W出现表达下调,分别为nephrin[免疫组化(50.074±1.83)比(55.244±1.96),P＜0.05;Western-Blot(0.364±0.121)比(0.544±0.137),P＜0.05];WT1[免疫组化(19.374±2.09)比(25.67±2.01),P＜0.05;Western-Blot(0.14±0.048)比(0.23±0.059),P＜0.05];PCX[免疫组化(68.19±1.86)比(71.35±1.67,P＜0.05;Western-Blot(0.51±0.186)比(0.77±0.205),P＜0.05]。随着时间的进展,肾小球足细胞密度、足细胞计数、相关分子nephrin、WT1、PCX蛋白的表达进一步减少,直至12W,各周间比较差异有显著性(P＜0.05)。氯沙坦治疗后肾小球足细胞的密度、足细胞的数量、nephrin、WT1、PCX的表达均出现上调,各指标DL1组分别为14.3+0.98、11.4±1.97、36.67±2.05、14.53+2.36、46.74±1.98,DL2组分别为13.5±1.14、10.9±2.03、34.83+1.98、13.48±2.24、44.29±1.83,与同期DM组各相应指标(分别为7.2±0.96、5.0±2.01、9.93±1.95、3.56±1.76、11.35±1.67)比较,P＜0.05。DL1组比DL2治疗组上调增加,但两组比较差异无统计学意义,P＞0.05。4.NC组大鼠尿中无nephrin,DM组大鼠尿中可出现nephrin,最早出现在2W,此时,尿中白蛋白增加尚不明显,随着病程的延长,尿中自蛋白明显增多,尿中nephrin也逐渐增多,8W达高峰后又渐减少。5.相关分析显示:尿白蛋白排泄分别与足细胞计数、足细胞密度、足细胞相关分子nephrin、WT1、PCX呈负相关(γ=-0.736,P＜0.01;γ=-0.578,P＜0.05;γ=-0.863,P＜0.01;γ=-0.758,P＜0.01;γ=-0.776,P＜0.01)。结论:1.糖尿病大鼠早期(2w)出现肾小球足细胞密度减低,足细胞相关分子nephrin、WT1、PCX表达下调,是糖尿病肾病早期损伤指标,足细胞及其相关分子nephrin、WT1、PCX蛋白参与了糖尿病肾病大鼠蛋白尿的发生及发展。2.氯沙坦通过延缓或抑制足细胞的丢失、维护正常足细胞数量,以及抑制糖尿病大鼠肾小球足细胞nephrin、WT1、PCX表达下调来减少尿蛋白、延缓DN进展。对已形成的糖尿病肾病氯沙坦治疗同样有效。3.糖尿病肾病早期nephrin即可从尿中排泄,尿nephrin可作为糖尿病肾病的早期诊断指标之一,还将有助于监测、判断糖尿病肾病的病程进展。