研究背景胰腺癌起病隐匿,早期准确诊断方式匮乏,患者预后极差,发病率与死亡率相当,5年总体生存率仅约10%,因而被称为“癌中之王”。数十年来,尽管胰腺癌的发病率不断降低,但胰腺癌患者的死亡率仍居高不下,往往确诊时已是局部进展或出现远处转移。目前,根治性手术仍是治疗胰腺癌的主要手段,但适用根治性手术的患者却十分有限。以手术治疗为主,多学科治疗手段为辅的综合治疗方式是目前胰腺癌治疗的主流选择。泛素特异性蛋白酶4（Ubiquitin-specific protease4,USP4）作为一种底物广泛的去泛素化酶,既往已被报道能够参与诸多肿瘤的进展,而目前尚缺乏关于USP4在胰腺癌中作用的相关文献研究报道。本研究旨在利用临床病理组织样本及基础实验明确USP4在胰腺癌进展中所扮演的角色,探究USP4在胰腺癌患者中的预后价值,为胰腺癌的精准靶向治疗提供潜在治疗靶点,进而指导胰腺癌的个体化精准治疗。研究目的探究USP4在胰腺癌组织中的表达情况及预后价值;揭示USP4在胰腺癌细胞体外增殖、体内成瘤、迁移侵袭及化疗耐药等细胞表型中的调控作用;初探USP4调控胰腺癌恶性生物学行为的下游通路及具体作用机制。研究方法1.利用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色对人胰腺癌组织及正常胰腺组织中USP4的表达情况进行检测,并探讨USP4表达与胰腺癌患者临床病理学指标的相关性及其预后意义。2.利用小干扰 RNA（small interfering RNA,siRNA）在 MIA PaCa-2 和 AsPC-1 胰腺癌细胞株中瞬时敲减USP4,使用慢病毒转染筛选并建立稳定USP4敲减及过表达双向调节MIA PaCa-2和AsPC-1稳转细胞株。3.利用CCK-8细胞增殖实验、平板克隆形成实验及裸鼠皮下移植瘤模型检测USP4表达对胰腺癌细胞体外增殖及体内成瘤能力的影响;细胞划痕愈合实验、transwell小室迁移侵袭实验用来探究USP4表达对胰腺癌细胞体外迁移侵袭能力的影响;细胞毒性实验用来检测USP4表达水平变化后,胰腺癌细胞对吉西他滨化疗敏感性的改变情况;利用western blot实验分析检测USP4表达改变对细胞周期相关蛋白表达的影响。4.利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）、蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction,PPI）数据库STRING以及交互数据集的生物通用存储库（Biological General Repository for Interactive Datasets,BioGRID）、串联质谱标签（Tandem Mass Tag,TMT）标记定量的蛋白质组学分析预测胰腺癌细胞中受USP4可能调控的生物学过程、潜在相互作用蛋白以及可能的下游信号通路;利用western blot实验分析检测肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）受体相关蛋白6（TNF receptor associated factor 6,TRAF6）及其下游NF-κB信号通路中关键蛋白的表达情况;利用IHC染色分析肿瘤组织中USP4与NF-κB信号通路中关键蛋白p65表达的相关性。5.利用环己亚胺蛋白质稳定性实验初探USP4对TRAF6的具体调控机制,进而使用在USP4稳转细胞株中瞬时敲减TRAF6的单向解救实验证明NF-κB信号通路在USP4诱导胰腺癌细胞恶性生物学行为的调控中所起的中介作用。6.本研究中所使用的统计学方法包括Mann-Whitney UU检验、χ2检验、Cox回归分析、Kaplan-Meier生存分析、Pearson相关性分析、Spearman相关性分析、Student’s t检验以及单因素方差分析（One-way ANOVA）。P值小于0.05被认为具有显著性差异。研究结果1.USP4在胰腺癌组织中的表达及其预后价值USP4在胰腺癌组织中的表达水平较正常胰腺组织显著升高（P<0.05）。USP4在胰腺癌组织中高表达与肿瘤组织分化较差显著相关（P<0.05）。单因素分析发现USP4表达水平与患者预后显著相关（P<0.05）,USP4高表达患者的疾病特异生存时间（Disease-specificsurvival,DSS）较 USP4 低表达患者明显缩短（P<0.05）。而在多因素分析中,USP4高表达是胰腺癌患者预后不良的独立危险因素（P=0.048,HR=1.389）。2.USP4对胰腺癌细胞恶性生物学行为的调控相比正常胰腺导管上皮细胞株,USP4在多数胰腺癌细胞株中表达升高。瞬时敲减USP4表达可以抑制MIAPaCa-2和AsPC-1细胞株的体外增殖及迁移侵袭能力（P<0.05）,并且USP4表达改变还能相应影响细胞周期相关蛋白的表达水平;过表达USP4能够增强MIA PaCa-2和AsPC-1细胞株的体外增殖和迁移侵袭能力（P<0.05）。在MIA PaCa-2的USP4双向调节稳转细胞株中,USP4表达改变还能够影响胰腺癌细胞株的体内成瘤能力（P<0.05）,但USP4表达改变却并不影响胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性（P>0.05）。3.USP4对胰腺癌恶性生物学行为调控的作用机制利用GSEA生物信息学分析发现USP4的差异表达可导致胰腺癌中基因富集情况的显著改变（NOM p-value=0.000,FDR q-value=0.015）,而且,USP4 的差异表达也与肿瘤相关基因差异富集及对应肿瘤进展信号通路显著相关（NOMp-value=0.000,FDR q-value=0.026）。之后,本研究对MIA PaCa-2 USP4敲减稳转细胞株及其对照组细胞株进行了 TMT定量标记的蛋白质组学分析。通过对具有显著表达差异的蛋白分子进行GO富集分析提示USP4可能参与影响胰腺癌细胞中cyclin-CDK复合物及减数分裂细胞周期G1/S期过渡的转录调控的形成。而KEGG富集分析结果表明USP4表达可以显著影响细胞周期及肿瘤进展相关信号通路中相关蛋白的表达。Western blot实验验证结果则证明USP4的表达改变可以影响NF-κB信号通路关键蛋白的表达,IHC染色结果则表明在本研究纳入的胰腺癌组织样本中,USP4的表达水平与NF-κB信号通路中的关键蛋白p65的表达水平呈显著正相关（r=0.3718,P<0.0001）。利用Pearson相关性分析和Spearman相关性分析联合PPI数据库STRING和BioGRID,并结合既往文献报道的USP4可能产生相互作用的蛋白时发现,USP4与NF-κB信号通路上游重要调控分子TRAF6的表达具有显著相关性（P<0.05）。之后的western blot实验验证结果提示在MIAPaCa-2和AsPC-1细胞株中瞬时敲减USP4的表达,TRAF6表达水平、p65表达水平以及第536位点丝氨酸磷酸化的p65表达水平均明显降低,而TAK1、TRAF2、p53、β-catenin和TGF-βRI的表达水平并无显著变化。qRT-PCR实验结果提示敲减USP4表达并不能在mRNA水平调控TRAF6的表达。上述结果说明USP4在胰腺癌中可能不参与调控p53信号通路、Wnt/β-catenin信号通路及TGF-β信号通路,且USP4并不影响NF-κB信号通路上游TRAF2和TAK1的表达,而可能仅通过调控TRAF6的蛋白表达,从而激活NF-κB信号通路。进一步的CHX蛋白质稳定性实验发现USP4能够稳定TRAF6的蛋白表达（P<0.05）。在USP4过表达的稳转细胞株中进行瞬时敲减TRAF6的单向解救实验表明,敲减TRAF6后能显著逆转USP4过表达诱导的胰腺癌细胞增殖和迁移侵袭能力的增强,并逆转NF-κB信号通路的激活（P<0.05）。结论1.与正常胰腺组织相比,USP4在胰腺癌组织中的表达显著升高;USP4高表达与胰腺癌患者预后不良密切相关,是判断胰腺癌患者预后不良的独立危险因素。2.USP4可以促进胰腺癌细胞体内外的增殖成瘤,增强胰腺癌细胞的体外迁移侵袭能力。3.USP4可以通过稳定TRAF6的蛋白表达,抑制蛋白降解,激活NF-κB信号通路,从而诱导胰腺癌的恶性生物学行为。